張 翠 張根葆 朱海龍 (皖南醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，安徽 蕪湖 241002)

銀杏總黃酮對(duì)糖尿病大鼠心肌轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響

張 翠 張根葆 朱海龍 (皖南醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的探討銀杏總黃酮對(duì)糖尿病大鼠的抗氧化作用及對(duì)心肌轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1表達(dá)的影響。方法SD大鼠隨機(jī)分為:正常對(duì)照組、糖尿病模型組、銀杏總黃酮組，采用腹腔注射鏈脲佐菌素(STE)法建立糖尿病大鼠模型，生化方法檢測(cè)血糖，血及心肌組織超氧化物歧化酶(SOD)的活性及丙二醛(MDA)的含量;ELISA法檢測(cè)各組心肌TGF-β1水平;光鏡觀察心肌組織形態(tài)改變。結(jié)果與糖尿病模型組相比，銀杏總黃酮組大鼠血糖水平明顯降低，血清及心肌組織SOD活性升高，MDA含量顯著降低，心肌組織TGF-β1蛋白水平與糖尿病模型組相比明顯下降。結(jié)論銀杏總黃酮能夠減輕STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌氧化應(yīng)激程度，降低心肌TGF-β1蛋白表達(dá)水平，對(duì)糖尿病心肌具有一定的保護(hù)作用。

銀杏總黃酮;糖尿病心肌病;轉(zhuǎn)化生長因子β1;氧化應(yīng)激

研究證實(shí)，氧化應(yīng)激啟動(dòng)并參與糖尿病心肌病(DCM)發(fā)生發(fā)展的各個(gè)環(huán)節(jié)〔1〕。銀杏提取物主要有效成分為黃酮類和銀杏內(nèi)酯類生物活性物質(zhì)，具有廣泛的藥用價(jià)值，其對(duì)心腦血管及多種疾病有確切治療作用〔2〕。黃酮類化合物具有抗氧化、抑制α2葡萄糖苷酶、抗炎、抑制醛糖還原酶等作用，對(duì)糖尿病及其并發(fā)癥具有一定的預(yù)防和治療作用〔3〕，但銀杏總黃酮對(duì)糖尿病心臟是否具有保護(hù)作用，文獻(xiàn)報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)探討銀杏總黃酮對(duì)DCM的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雌性SD大鼠28只，體重180～220 g，由南京青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供。銀杏葉總黃酮購自南京青澤醫(yī)藥有限公司;STZ購自Sigma公司;血糖檢測(cè)試劑盒購自長春迪瑞實(shí)業(yè)有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1檢測(cè)試劑盒(ELISA)購自美國RD公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的建立與分組 大鼠隨機(jī)分為3組:正常對(duì)照組(8只):生理鹽水2 m l/d灌胃;糖尿病模型組(10只):生理鹽水2 ml/d灌胃;銀杏總黃酮組(10只):銀杏總黃酮250 mg·kg－1·d－1灌胃。糖尿病模型組和銀杏總黃酮組大鼠禁食12 h后腹腔注射溶于無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)的STZ，用量為65 mg/kg，正常對(duì)照組注射等體積的無菌枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液，48 h后空腹尾靜脈采血測(cè)血糖，血糖值≥13.8 mmol/L的大鼠視為糖尿病模型復(fù)制成功。

1.2.2 標(biāo)本收集 模型復(fù)制成功30 d后處死各組大鼠，3%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠，頸動(dòng)脈插管取血，4℃離心分離血清置－20℃保存。打開胸腔后，迅速整體取出心臟并放入冰生理鹽水中漂洗，取心尖部組織置－80℃保存，用于檢測(cè)心肌組織SOD活性、MDA含量及TGF-β1蛋白水平，余下部分于4%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，供形態(tài)學(xué)檢測(cè)。

1.2.3 生化指標(biāo)的檢測(cè) 取少許心尖部組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，剪碎，放入勻漿器內(nèi)，以預(yù)冷的生理鹽水為勻漿介質(zhì)，在冰上研磨制成10%組織勻漿，用低溫低速離心機(jī)4 000 r/min，離心10 min，取上清液測(cè)定。應(yīng)用羥胺法測(cè)血及心肌勻漿SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量，均嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 ELISA法檢測(cè)血清及心肌TGF-β1水平 采用ELISA法測(cè)大鼠血和心肌TGF-β1水平，嚴(yán)格按試劑盒說明書檢測(cè)。

1.2.5 形態(tài)學(xué)檢測(cè) 心肌組織行石蠟切片，HE染色，光鏡觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，數(shù)據(jù)用±s表示，兩組間差異顯著性比較用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠的一般狀況 糖尿病模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食、多尿等典型的糖尿病表現(xiàn)，正常對(duì)照組飲水、進(jìn)食量、尿量基本正常，精神狀態(tài)良好，體重明顯增加，銀杏總黃酮治療組大鼠多飲、多食、多尿現(xiàn)象均有一定改善。

2.2 銀杏總黃酮對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠體重及血糖的影響由表1可知，與正常對(duì)照組相比，糖尿病模型組大鼠血糖明顯升高，經(jīng)銀杏總黃酮治療后，大鼠血糖水平與模型組相比顯著降低;模型組大鼠體重與對(duì)照組相比顯著下降，而銀杏總黃酮治療組體重有所增加。

2.3 銀杏總黃酮對(duì)大鼠血清SOD活性、MDA含量的影響 糖尿病模型組大鼠血清SOD活性與正常對(duì)照組比較明顯降低，MDA含量顯著升高，而銀杏總黃酮治療組大鼠的SOD活性較糖尿病模型組有顯著提高，與此相應(yīng)，MDA含量明顯下降。見表2。

2.4 銀杏總黃酮對(duì)大鼠心肌組織SOD活性、MDA含量的影響從表2看出，糖尿病模型組大鼠心肌組織SOD活性與正常對(duì)照組比較明顯降低，而MDA含量顯著升高;銀杏葉總黃酮治療組大鼠心肌SOD活性較糖尿病模型組有顯著提高;同時(shí)，MDA含量明顯下降。

2.5 銀杏總黃酮對(duì)大鼠血清及心肌組織TGF-β1表達(dá)的影響與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠血清及心肌組織

TGF-β1表達(dá)水平顯著增高;而銀杏總黃酮治療組大鼠血清及心肌組織TGF-β1表達(dá)水平明顯下降。見表2。

表1 銀杏總黃酮對(duì)各組大鼠體重及血糖的影響(±s)

表1 銀杏總黃酮對(duì)各組大鼠體重及血糖的影響(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別 n 體重(g)治療前 治療后 血糖(mmol/L)8 205.75±11.34 303.75 ±20.48 5.75±1.02糖尿病模型組 10 209.60±12.29 165.90±12.321)25.33±5.071)銀杏總黃酮組 10 204.10 ±10.18 225.40±16.983)20.64±4.182)正常對(duì)照組

表2 銀杏葉總黃酮對(duì)大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表達(dá)的影響(±s)

表2 銀杏葉總黃酮對(duì)大鼠血清、心肌SOD活性、MDA含量、TGF-β1表達(dá)的影響(±s)

與正常對(duì)照組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與糖尿病模型組比較:3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n 血清SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)心肌SOD(U/ml) MDA(nmol/ml)TGF-β1血清(ng/L) 心肌(ng/L)0.30 12.70±2.21 50.18±12.40糖尿病模型組 10 99.47±16.181) 7.83±1.141) 218.06±43.911) 2.89±0.532) 21.86±4.251) 118.26±26.191)銀杏總黃酮組 10 117.86±17.413) 6.52±1.193) 261.87±41.293) 2.42±0.413) 17.56±3.683) 90.17±15.994)正常對(duì)照組 8 138.48±22.14 4.78±0.77 283.12±68.93 1.59±

2.6 銀杏總黃酮對(duì)大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)的影響 正常對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，著色均勻，糖尿病模型組大鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，扭曲，心肌細(xì)胞肥大，空泡變性，并見局灶性心肌纖維溶解壞死，結(jié)構(gòu)不清，銀杏總黃酮治療組病變與模型組相比明顯減輕。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理比較(HE，×400)

3 討論

高血糖是DCM發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，糖尿病血糖增高后能夠啟動(dòng)多種有害因素，進(jìn)而引起心肌纖維化和膠原沉積。多種黃酮類藥物能降低糖尿病患者血糖水平〔4〕，本結(jié)果提示其在一定程度上能夠改善糖尿病大鼠血糖水平，與以往報(bào)道相符。

研究發(fā)現(xiàn)，通過抗氧化劑抑制心肌細(xì)胞的死亡，可以明顯阻止糖尿病的心臟毒性〔5〕，同時(shí)研究表明氧化應(yīng)激在DCM的發(fā)病中起著重要作用，本研究結(jié)果提示總黃酮能夠增強(qiáng)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心肌抗氧化能力，降低心臟氧化應(yīng)激水平，保護(hù)糖尿病心臟。

心肌間質(zhì)膠原纖維沉積和心肌纖維化是DCM的一種特征性病理改變，致心室收縮及舒張功能不全，最終導(dǎo)致心力衰竭〔6〕。多種細(xì)胞因子參與其發(fā)病過程，其中TGF-β1是關(guān)鍵的致心肌纖維化因子，DM時(shí)的高血糖、AngⅡ及胰島素抵抗等均可刺激TGF-β1分泌，增多后的TGF-β1能夠通過受體刺激心臟成纖維細(xì)胞合成Ⅰ型、Ⅲ型膠原及纖維連接蛋白(FN)，增加心肌組織ECM含量，同時(shí)下調(diào)蛋白水解酶活性，抑制纖溶酶原、膠原酶原、基質(zhì)酶原等酶原激活物的產(chǎn)生，減少膠原降解，增加心肌細(xì)胞外基質(zhì)的含量，促進(jìn)心肌纖維化〔7〕。以上研究均表明TGF-β1在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，因此，抑制心肌TGF-β1表達(dá)能夠延緩糖尿病心肌損害。本實(shí)驗(yàn)提示銀杏總黃酮能夠抑制DM大鼠心肌TGF-β1的表達(dá)。

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Effect of total ginkgo flavone-glycoides on the expression of transform ing grow th factor-β1 in myocardium of diabetic rats

ZHANG Cui，ZHANG Gen-Bao，ZHU Hai-Long.
Department of Pathophysiology，W annan M edical College，W uhu 241002，Anhui，China

ObjectiveTo explore the effects of total ginkgo flavone-glycoides on the oxidative stress and the expression of transforming growth factor(TGF)-β1 inmyocardium of diabetic rats.MethodsSD ratswere randomly divided:normal control，diabetesmodel and total ginkgo flavone-glycoides groups.Diabetesmodels were induced by STZ through intraperitoneal injection.Blood glucose，the activities of superoxide dismutase(SOD)and the content of malonaldehyde(MDA)in serum and myocardium were analyzed by biochemical methods.ELISA was used to detect the expression of TGF-β1 in myocardial tissue.The morphological changes of myocardium were checked through microscopy.ResultsCompared with diabetesmodel group，level of the blood glucose and the content of MDA were reduced，and the activities of SOD in serum and myocardium were increased in total ginkgo flavone-glycoides.Level of TGF-β1 in myocardium in total ginkgo flavone-glycoides group was dramatically decreased compared with that of diabetesmodel group.ConclusionsTotal ginkgo flavoneglycoides inhibits the expression of TGF-β1 inmyocardium of diabetic rats induced by STZ.Itmay play a protective effect onmyocardium of diabetic rats.

Total ginkgo flavone-glycoides;Diabetic cardiomyopathy;Transforming growth factor-β1;Oxidative stress

R587.2

A

1005-9202(2012)16-3467-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.055

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目基金(KJ2011A266);皖南醫(yī)學(xué)院中青年科研基金(WK201012)

張根葆(1957-)，男，碩士，教授，主要從事心血管病理生理學(xué)方面的研究。

張 翠(1981-)，女，碩士，講師，主要從事糖尿病及心血管病理生理學(xué)方面的研究。

〔2011-06-20收稿 2011-09-18修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)