王淑強(qiáng) 郭 穎 李海軍 張林西 李玉珍 郝秀輕 (河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

苦參堿誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡及其對(duì)Bax表達(dá)的影響

王淑強(qiáng) 郭 穎 李海軍 張林西 李玉珍 郝秀輕 (河北北方學(xué)院病理教研室，河北 張家口 075000)

目的探討苦參堿在體外誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡作用及其機(jī)制。方法用MTT方法檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，用流式細(xì)胞儀(FCM)分別檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡情況，MCF-7細(xì)胞線粒體跨膜電位及MCF-7細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)情況。結(jié)果苦參堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率測(cè)定結(jié)果顯示，不同濃度的苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組相比存在明顯差異(P＜0.05)，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)及時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比均有顯著差異(P＜0.05)，隨著苦參堿濃度的增高，凋亡的發(fā)生率也相應(yīng)提高，呈正相關(guān)。線粒體跨膜電位檢測(cè)，苦參堿處理組MCF-7細(xì)胞羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)明顯低于對(duì)照組，存在顯著差異(P＜0.05)，并隨苦參堿濃度的增高而減少，呈負(fù)相關(guān)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)Bax蛋白表達(dá)顯示，Bax蛋白表達(dá)上調(diào)，與對(duì)照組相比，存在顯著差異(P＜0.05)，且隨作用濃度增高表達(dá)增強(qiáng)，呈正相關(guān)。結(jié)論中藥苦參堿在體外能抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞之生長(zhǎng)抑制，并能誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡。

苦參堿;細(xì)胞凋亡;MCF-7cells;體外誘導(dǎo)

苦參堿是從傳統(tǒng)中藥中分離出的一種生物堿，是中藥苦參的主要有效成分，屬于四環(huán)的喹諾里丙啶類。大量的藥理和臨床研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗炎，抗病毒，抗纖維化，免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用〔1〕。近年來(lái)，有人發(fā)現(xiàn)苦參堿還具有抗腫瘤的作用，可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)凋亡，誘導(dǎo)腫瘤分化，對(duì)肝癌、肺癌、胃癌、大腸癌、食管癌和乳腺癌等多種癌細(xì)胞具有抑制作用〔2，3〕。本研究探討苦參堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的抑制和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用及對(duì)凋亡抑制基因Bax表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 苦參堿購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)股份公司，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7由我院中心實(shí)驗(yàn)室提供，RPMI-1640培養(yǎng)液，細(xì)胞凋亡羅丹明123染色試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，新生胎牛血清購(gòu)自天津市川頁(yè)生化制品有限公司。胰酶、四甲基噻唑藍(lán)MTT購(gòu)自北京普京康生物工程有限公司。FITCBax蛋白抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，SW-GJ-2FD型超凈工作臺(tái)，3319型CO2培養(yǎng)箱，BDFACS-Aria流式細(xì)胞儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代 將凍存的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，從－176℃ 液氮罐中取出，快速放入37℃ ～42℃左右水浴箱中快速解凍，融化后將凍存管置于離心機(jī)離心，1 500 r/min，離心7 min，將離心后的凍存管在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)，棄去凍存液后加入2 ml配置好的RPMI-1640培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打懸浮細(xì)胞后將培養(yǎng)液移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液加至4～5 m l，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，細(xì)胞占瓶底80%左右即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液后加入消化液約2 m l左右進(jìn)行消化，在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞開(kāi)始收縮細(xì)胞間出現(xiàn)裂隙，尚未完全變圓前，即可終止消化，棄去消化液后加入新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打貼壁細(xì)胞，直到完全懸浮后，均分移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，然后繼續(xù)在37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

1.2.2 苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率MTT實(shí)驗(yàn)方法 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，用0.25%胰酶消化加培養(yǎng)液輕輕吹打懸浮細(xì)胞，將濃度調(diào)到2×104個(gè)/ml，每孔100μl接種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)良好后，分別加入 100μl苦參堿溶液使其濃度分為 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/m l作為實(shí)驗(yàn)組，另外加入與實(shí)驗(yàn)組等量的培養(yǎng)液作為對(duì)照組，各設(shè)4個(gè)復(fù)孔。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育?？鄥A作用24、46、72 h后進(jìn)行MTT檢測(cè)，檢測(cè)前每孔加入100μl DMSO，輕輕振蕩，溶解約10～15 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。選擇492 nm測(cè)量波長(zhǎng)。計(jì)算出每個(gè)時(shí)間段中對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組4個(gè)復(fù)孔的平均吸光度值，代入下列公式計(jì)算。計(jì)算公式:腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)=(1－實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度)×100%。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，胰酶消化，加預(yù)冷的PBS洗滌，輕輕吹打貼壁細(xì)胞使之懸浮。收集細(xì)胞于尖底離心管內(nèi)離心(1 500 r/min，7min)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，相同方法PBS洗滌兩次，兩次離心前先將細(xì)胞移入流式測(cè)定管內(nèi)，離心后流式測(cè)定管內(nèi)加入100μl結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，相繼加入5μl Annexin V/FITC和10μl碘化丙啶溶液(20μg/ml)，混勻后室溫下避光孵育15 min，加入400μl結(jié)合緩沖液及時(shí)上流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4 線粒體跨膜電位的檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞5瓶，選取其中4瓶分別加入含培養(yǎng)液的苦參堿4 ml，苦參堿濃度分別為0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組，取1瓶加入等量培養(yǎng)液為對(duì)照組。細(xì)胞37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。藥物作用24 h后細(xì)胞經(jīng)0.25% 胰酶消化重懸于培養(yǎng)液中，取細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)/m l，加入羅丹明123染液10μg/ml 37℃5%CO2培養(yǎng)箱孵育20 min離心，培養(yǎng)液洗細(xì)胞兩次，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5 Bax蛋白的檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)分24 h和48 h組，均隨機(jī)自選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞5瓶，選取其中4瓶分別加入含培養(yǎng)液的苦參堿 4 ml，苦參堿濃度分別為 0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml為實(shí)驗(yàn)組，取1瓶加入等量培養(yǎng)液為對(duì)照組。37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。藥物作用24 h和48 h后，將細(xì)胞0.25%胰酶消化，棄去消化液，加預(yù)冷的PBS洗滌，輕輕吹打貼壁細(xì)胞使之懸浮，收集細(xì)胞于尖底離心管內(nèi)離心(1 500 r/min 7 min)并調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105個(gè)，相同方法PBS洗滌兩次，二次離心前先將細(xì)胞移入流式測(cè)定管內(nèi)離心，離心后24 h和48 h各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均加入Bax單克隆抗體100μl，混勻后室溫下避光孵育30 min，上流式細(xì)胞儀(FACS)分析。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率 苦參堿作用于乳腺癌MCF-7細(xì)胞24、48和72 h的生長(zhǎng)抑制率分別為:6.61% ～35.58%、7.97% ～51.56%和11.98% ～68.31%。從表1看出，在24、48 h兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組中除了0.25 mg/ml及0.5 mg/ml這兩個(gè)低濃度組在組內(nèi)比較無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，包括72 h在內(nèi)的實(shí)驗(yàn)各組，組內(nèi)各濃度之間苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率比較，均存在顯著差異(P＜0.05)，苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率隨藥物濃度的增加而增高，呈劑量-效應(yīng)正相關(guān)，并且隨時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制率也相應(yīng)提高，呈時(shí)間-效應(yīng)正相關(guān)。見(jiàn)表1。

表1 苦參堿對(duì)MGF-7細(xì)胞的抑制率(±s，%)

表1 苦參堿對(duì)MGF-7細(xì)胞的抑制率(±s，%)

與前一濃度比較:1)P＜0.05;與上一時(shí)間點(diǎn)比較:2)P＜0.05

時(shí)間點(diǎn)0.25 mg/ml 0.5 mg/m l 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 6.61±0.50 7.67±0.64 19.50±2.12 35.58±1.38 48 h 7.97±0.41 9.61±0.67 32.56±1.602) 51.56±1.722)72 h 11.98±1.11 17.14±1.211)54.46±2.931)2)68.31±2.131)2)

2.2 苦參堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 苦參堿處理MCF-7細(xì)胞24 h后，用雙標(biāo)法AnnexinV和PI對(duì)MCF-7細(xì)胞標(biāo)記后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示:苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞有明顯的凋亡促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)組凋亡發(fā)生率對(duì)于4.17%～19.63%之間，與對(duì)照組 〔(1.10±0.08)%〕相比，均有顯著差異 (P＜0.05)。藥物各濃度組之間相比也存在顯著差異(P＜0.05)，并隨藥物濃度的提高，0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿組凋亡的發(fā)生率也相應(yīng)增高，分別為(4.17±0.25)%、 (6.60±0.18)%、 (15.32±0.21)%和(19.63±0.17)%，且呈正相關(guān)。

2.3 線粒體膜電位的檢測(cè)結(jié)果 苦參堿處理MCF-7細(xì)胞24 h，羅丹明123經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果顯示，苦參堿處理MCF-7細(xì)胞羅丹明染色陽(yáng)性數(shù)明顯低于對(duì)照組，與對(duì)照組〔(83.00±1.42)%〕相比有明顯差異 (P＜0.05)，并隨苦參堿作用濃度的增高而減少，為負(fù)相關(guān)。0.25、0.5、1.0、2.0 mg/ml苦參堿組線粒體膜電位分別為 (66.03±2.08)%、(61.28±1.29)%、 (60.55±0.87)%及 (56.30±1.87)%。0.5和1.0 mg/ml兩個(gè)濃度組相比較無(wú)明顯差異 (P＞0.05)外，各濃度組之間均有明顯差異 (P＜0.05)，因羅丹明染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化反映了線粒體膜電位的變化，具有一致性。換言之，實(shí)驗(yàn)組乳腺癌MCF-7細(xì)胞線粒體跨膜電位顯著低于對(duì)照組，隨作用藥物濃度的增加而下降程度加大，呈負(fù)相關(guān)。

2.4 苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞Bax表達(dá)的影響 苦參堿作用于MCF-7細(xì)胞24 h、48 h后實(shí)驗(yàn)組Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別介于0.80% ～11.93%和1.15% ～16.83%，均高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比差異顯著(P＜0.05)，各濃度組間比較Bax蛋白陽(yáng)性表達(dá)也存在顯著差異，且Bax蛋白表達(dá)隨藥物作用濃度增高表達(dá)增高，呈正相關(guān)。見(jiàn)表2。

表2 苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞Bax表達(dá)的影響(±s，%)

表2 苦參堿對(duì)MCF-7細(xì)胞Bax表達(dá)的影響(±s，%)

與對(duì)照組比較:1)P＜0.05

時(shí)間點(diǎn) 對(duì)照組0.25 mg/m l 0.5 mg/ml 1.0 mg/ml 2.0 mg/m l 24 h 0.38±0.05 0.80±0.821)1.30±0.821)6.30±0.081)11.93±0.341)48 h 0.43±0.05 1.15±0.131)2.73±0.171)10.45±0.641)16.83±0.821)

3 討論

苦參堿作為多種中藥的有效成分之一，已被證明具有重要的生物學(xué)活性，如抗癌、抗病毒、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用，體外實(shí)驗(yàn)表明苦參堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制或殺傷作用，對(duì)HEPG2、K562、HL260有明顯的抑制作用，并能誘導(dǎo)分化和凋亡〔4，5〕。Hua 等〔6〕的研究表明，苦參堿可誘導(dǎo)細(xì)胞色素 C釋放、激活caspase-3和caspase-9從而通過(guò)線粒體途徑誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，隨苦參堿的作用濃度增高作用時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用也增強(qiáng)。不同的凋亡指數(shù)(AI)，即凋亡細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，在一定程度上與其對(duì)放、化療的敏感性、腫瘤分化程度、分級(jí)、發(fā)展及腫瘤的生物學(xué)行為有關(guān)。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是目前進(jìn)行腫瘤控制與治療的可行方法之一，也是篩選抗癌藥物的指標(biāo)之一。

本結(jié)果中MCF-7細(xì)胞凋亡率與王利民〔7〕報(bào)道的同濃度下苦參堿作用青肉瘤QS732細(xì)胞，檢測(cè)的凋亡率9.8%、16.9%相近，但高于馬玲娣等〔8〕報(bào)道的苦參堿作用與小鼠H22肝癌細(xì)胞檢測(cè)值4.32%和11.27%，這說(shuō)明不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)苦參堿的敏感性不同，可能觸發(fā)癌細(xì)胞凋亡機(jī)制也大不相同。

羅丹明123是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑，其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失，而在凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜完整性被破壞，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放，引起線粒體跨膜電位的崩解。Rh123從新釋放出線粒體，從而發(fā)出黃綠色熒光，可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化和凋亡的發(fā)生。研究表明線粒體膜電位的降低和去極化可停止合成ATP，使能量代謝受損，從而導(dǎo)致線粒體膜通透性開(kāi)放，細(xì)胞發(fā)生凋亡〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)苦參堿可能影響了線粒體跨膜電位MMP通道的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致MMP通道開(kāi)放，觸發(fā)凋亡的發(fā)生，也可能改變了線粒體膜內(nèi)外兩側(cè)的某些離子使跨膜電位崩潰，MMP通道開(kāi)放，位于內(nèi)外膜上的許多離子會(huì)逆流，均有可能觸發(fā)凋亡的產(chǎn)生。我們的實(shí)驗(yàn)證實(shí)苦參堿能夠降低線粒體跨膜電位，誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡，由哪種途徑引起有待進(jìn)一步探討。

Bax家族是細(xì)胞內(nèi)重要的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡抑制物成員之一，這些抑制物制約細(xì)胞凋亡機(jī)器的運(yùn)行，維持細(xì)胞的正常生存，在細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制方面，Bax是迄今研究的最深入、廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。Bax是一種細(xì)胞內(nèi)膜蛋白，主要定位于線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核膜。研究顯示Bax能夠通過(guò)下列途徑維持細(xì)胞正常，防止凋亡的發(fā)生。①如細(xì)胞氧化，還原狀態(tài)(如增加GSH，抑制ROS的產(chǎn)生與活化，增強(qiáng)過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶的活性等)，漿膜的變化(抑制磷酸酯酰絲氨酸外翻)，細(xì)胞內(nèi)離子抑制(抑制Ca2+自內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外流和向核外流，防止胞漿酸化)，抑制 caspase-3的活化等。②Bax與Bcl-2能夠抑制MMP開(kāi)放和維持膜電位，進(jìn)而阻止線粒體內(nèi)cyto C和AIF的釋放，也有人認(rèn)為Bax與P53依賴的凋亡信號(hào)途徑重要中介物之一〔10，11〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)苦參堿可能通過(guò)某種途徑激活Bax基因并促進(jìn)Bax蛋白合成，并從胞漿移至線粒體外膜，形成多聚體或高度有序的寡聚體，啟動(dòng)MMP通道開(kāi)放，使線粒體跨膜電位下降或崩潰，啟動(dòng)凋亡程序，一起凋亡。另外，Bax的高表達(dá)也可能增強(qiáng)了某種凋亡信號(hào)，引發(fā)P53作用增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，移至細(xì)胞增殖。

綜上，苦參堿通過(guò)多種環(huán)節(jié)，不同途徑和方式對(duì)腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)分化，這種作用不是單一和獨(dú)立的，有可能是極為復(fù)雜，互相關(guān)聯(lián)，互相促進(jìn)，甚至是多種因素綜合作用的結(jié)果。由此可見(jiàn)，苦參堿是極具前途的抗腫瘤中藥活性成分，尤其是對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞具有現(xiàn)實(shí)意義，因而具有廣闊的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用前景。

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R285

A

1005-9202(2012)16-3489-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.16.067

王淑強(qiáng)(1960-)，女，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事腫瘤學(xué)研究。

〔2011-03-03收稿 2011-07-30修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)