趙 丹 劉新莉 馬 萍 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

鈣網(wǎng)織蛋白重組腺病毒載體構(gòu)建及體外表達(dá)

趙 丹 劉新莉 馬 萍 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

目的構(gòu)建鈣網(wǎng)織蛋白(CRT)基因重組腺病毒載體，并檢測(cè)其在293LP細(xì)胞中的表達(dá)。方法根據(jù)Genbank中提供的CRT基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物，以人乳腺癌組織cDNA文庫(kù)為模板采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增人CRT基因片段，測(cè)序后將CRT基因片段定向克隆至pShuttle-CMV重組穿梭載體，進(jìn)而將穿梭載體克隆至PacⅠ限制性?xún)?nèi)切酶線(xiàn)性化的腺病毒載體pAdxsi。結(jié)果重組穿梭載體pShuttle-CRT經(jīng)EcoRI/KpnⅠ酶切鑒定連接成功。酶切穿梭載體將CRT片段克隆至腺病毒載體pAdxsi得到Ad-CRT，鑒定證實(shí)Ad-CRT載體構(gòu)建成功。Ad-CRT轉(zhuǎn)染293LP細(xì)胞并通過(guò)Western印跡法和Real-time PCR法證實(shí)其體外表達(dá)。結(jié)論成功構(gòu)建CRT重組腺病毒載體Ad-CRT并證實(shí)其在293LP細(xì)胞中表達(dá)。

鈣網(wǎng)織蛋白(CRT);腺病毒載體;基因治療

抗原特異性腫瘤免疫治療和抑制腫瘤血管生成治療的方法能夠區(qū)分腫瘤與非腫瘤細(xì)胞，進(jìn)而達(dá)到全身系統(tǒng)性治療腫瘤的目的〔1，2〕。鈣網(wǎng)蛋白(CRT)是熱休克蛋白家族成員，為哺乳動(dòng)物體內(nèi)高度保守的Ca2+結(jié)合蛋白。近期研究表明，由抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(TAP)轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)腔內(nèi)的肽段與CRT相連，成為抗原處理及遞呈過(guò)程中熱休克蛋白(HSP)的交接分子，參與誘導(dǎo)MHC-Ⅰ類(lèi)分子限制的抗原特異性的CTL，產(chǎn)生細(xì)胞免疫。既往腫瘤治療研究中，研究人員利用CRT某些基因特性將其用于腫瘤的基因治療，并已取得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔3〕。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了CRT重組腺病毒載體Ad-CRT，并證實(shí)其能夠在293LP細(xì)胞中有效表達(dá)CRT蛋白，為下一步開(kāi)展腫瘤特異性基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 DH5α化學(xué)感受態(tài)菌株，真核表達(dá)質(zhì)粒PUC19、pAdxsi腺病毒質(zhì)粒及pShuttle-CMV(-)重組穿梭載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。人乳腺癌組織由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤外科提供。Platinum pfx DNA Polymerase試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司;PCR試劑盒購(gòu)買(mǎi)自大連寶生物公司;限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自New England Biolabs公司;質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒(柱離心型)、DNA凝膠回收與純化試劑盒 (柱離心型)購(gòu)自威格拉斯生物技術(shù)(北京)有限公司;人胚腎細(xì)胞293LP購(gòu)于中科院上海生物研究所細(xì)胞庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 重組穿梭載體pShuttle-CRT的構(gòu)建及鑒定 將pShuttle-CMV重組穿梭載體用EcoRI/KpnI酶切:酶切體系及反應(yīng)條件為 pShuttle-CMV 2 μl，10×緩沖液 5μl，10×BSA 5μl，EcoRI 1.5 μl，KpnI1.5 μl，ddH2O 35 μl，37 ℃水浴 3.5 h。CIP 0.5μl去磷酸化，37℃水浴0.5 h。1%的瓊脂糖凝膠電泳，并切膠回收3.4 kb片段。人CRT片段制備:取人乳腺癌組織0.1 g，提取總RNA。使用Platinum pfx DNA polymerase試劑盒進(jìn)行Touch Down PCR擴(kuò)增，CRT引物序列為:上游引物:5'-CGGGGTACCACCATGCTGCTATCCGTG-3'，下游引物:5'-CCGGAATTCCTACAGCTCGTCCT-3'。PCR反應(yīng)條件:94℃5 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán); 延伸72℃ 7min，4℃。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳后，并切膠回收并純化目的基因。行EcoRI，KpnI酶切，CRT30μl，操作同前，回收1.2 kb片段。將處理好的載體片段和CRT片段用T4 DNA連接酶連接，連接體系及反應(yīng)條件:CRT產(chǎn)物片段 6μl，pShuttle-CMV 2μl，10×ligase緩沖液 1μl，T4 DNA ligase 1μl，22℃ 3.5 h。取3μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞DH5α菌株，涂布到卡那抗性固體培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)過(guò)夜。挑取若干單克隆菌落，接種至卡那抗性液體培養(yǎng)基，于搖床中37℃300 r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。參照威格拉斯質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒。

1.2.2 構(gòu)建pAdxsi-CRT病毒質(zhì)粒 I-CeuI+I-SceI雙酶切處理pAdxsi載體，并做CIP去磷酸化處理酶切反應(yīng)體系及反應(yīng)條件:pAdxsi 3.5 μl，10×緩沖液 5 μl，10×BSA 5 μl，I-CeuI(NEB，5 U/μl)2 μl，I-SceI(NEB，5 U/μl)2 μl，ddH2O 36 μl，37℃3.5 h，CIP 0.5 μl去磷酸化，37℃0.5 h。上述酶切反應(yīng)體系中加入10%SDS 75℃ 滅活10 min。用乙醇沉淀法回收載體:酶切體系加ddH2O 100μl，酚75μl，氯仿75μl，充分混勻，12 000 r/min離心;吸上清至新的離心管中，加入醋酸鈉20μl，再加入無(wú)水乙醇500μl，－20℃沉淀15 min;4℃離心，吸去上清，加入70%乙醇500μl，4℃離心，吸去上清，晾干5 min，加入 ddH2O 100μl。I-CeuI+ISceI雙酶切處理插入片段 pShuttle-CRT，pShuttle-CRT 2μl，步驟同前。1%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，用DNA凝膠回收與純化試劑盒(柱離心型)回收。將處理好的載體片段和插入片段用T4 DNA連接酶連接，步驟同前。將腺病毒載體片段及CRT目的片段連接并提取后以XhoⅠ酶切鑒定，反應(yīng)條件:Ad-CRT 1 μl，10 × Buffer 1 μl，10 × BSA 1 μl，XhoI(NEB，20 U/μl)0.3 μl，ddH2O 6.7 μl，37℃ 1.5 h。1%瓊脂糖凝膠電泳。陽(yáng)性克隆:14 kb，11.8 kb，2.66 kb，2.47 kb，2.2 kb，1.45 kb，0.6 kb。

1.2.3 重組腺病毒載體Ad-CRT的擴(kuò)增、純化及滴度測(cè)定

293LP細(xì)胞培養(yǎng)于MEM培養(yǎng)基的六孔板 (5×105個(gè)細(xì)胞/孔)中過(guò)夜。線(xiàn)性化重組腺病毒載體 Ad-CRT:Ad-CRT 10μl，10×Buffer 5μl，PacI 20 U，ddH2O 39 μl，37 ℃水浴 3.5 h。取線(xiàn)性化 Ad-CRT 5μl稀釋于 300μl MEM，以 Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，6 h換液。每天觀察細(xì)胞出毒跡象。轉(zhuǎn)染后第13天出現(xiàn)明顯噬斑，細(xì)胞大部分脫落。收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融3次，3 000 r/min離心，收集上清作為第一代毒種。采用TCID50方法測(cè)定病毒滴度。

1.2.4 Real-time PCR法檢測(cè)CRT基因表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟提取單純細(xì)胞、感染48 h按MOI(感染復(fù)數(shù))100∶1的空腺病毒載體細(xì)胞和Ad-CRT細(xì)胞三組細(xì)胞的總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟以各組RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，上游引物:5'-GCACTTGGATCCACCCAGAA-3'，下游引物:5'-GAAGTTGTCAAAGATGGTGCCAGA-3'。反應(yīng)條件為∶37℃15 min，85℃ 5 s。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟以cDNA為模板進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為∶95℃ 30 s，95℃5 s，60℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.5 Western印跡法檢測(cè)CRT蛋白的表達(dá) RIPA法提取3組 (同1.2.4)細(xì)胞蛋白，BCA法定量蛋白，變性后SDSPAGE凝膠電泳 (100 V，1.5 h)，半干法轉(zhuǎn)膜 (80 V，1.5 h)，羊抗人CRT抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗先后雜交后ECL顯色。

2 結(jié)果

2.1 重組穿梭質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果 pShuttle-CRT EcoRI/KpnI酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 重組腺病毒質(zhì)粒鑒定結(jié)果 pAdxsi-CRT XhoI酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 Real-time PCR檢測(cè)CRT的mRNA表達(dá)水平 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后RNA表達(dá)的倍數(shù):293LP組為9.5倍，AD組為22倍，AD-CRT組為240倍。

2.4 Western印跡法檢測(cè)CRT基因的蛋白表達(dá)水平結(jié)果 見(jiàn)圖3。

圖1 pShuttle-CRT鑒定結(jié)果

圖2 pAdxsi-CRT鑒定結(jié)果

圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后CRT蛋白的表達(dá)

3 討論

新近研究發(fā)現(xiàn)，CRT基因不僅在腫瘤特異性免疫原性方面起作用，而且能夠抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖而對(duì)其他細(xì)胞系無(wú)任何作用。另有研究表明，腫瘤細(xì)胞表面CRT的表達(dá)，能誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬，從而介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的免疫原性死亡。CRT除能起到分子伴侶和清除凋亡細(xì)胞的作用，還能抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生。CRT包含N-、P-和C-三個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)域。在CRT的氨基末端，包括180個(gè)氨基酸序列是結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞接觸的整合素α亞單位的區(qū)域，是潛在和選擇性?xún)?nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑，具有明顯的抑制腫瘤血管生成作用。因此，CRT的導(dǎo)入有望成為腫瘤基因治療的一種有效策略。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)紫外線(xiàn)輻射及蒽環(huán)類(lèi)抗生素能夠誘導(dǎo)CRT暴露于腫瘤細(xì)胞表面，引發(fā)吞噬細(xì)胞吞噬功能，進(jìn)而激發(fā)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)〔4～6〕。已有研究表明，Ad-CRT/HPV16-E7成功構(gòu)建，并在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的抑制腫瘤血管生成及增強(qiáng)機(jī)體產(chǎn)生E7特異性T細(xì)胞擴(kuò)增的抗E7表達(dá)的腫瘤的功能〔3〕，然而Ad-CRT載體的構(gòu)建尚未有報(bào)道。因此，本研究選擇這個(gè)基因，將靶向免疫性治療及抑制腫瘤血管生成治療二者結(jié)合，為進(jìn)一步的體內(nèi)外抗腫瘤治療試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。

腺病毒載體具有可感染分裂和非分裂細(xì)胞、滴度高、不整合到染色體中，無(wú)插入致突變性、能同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因等多種優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于腫瘤的基因治療中〔7〕。我們選擇pAdxsi腺病毒載體系統(tǒng)，通過(guò)引入特殊酶切位點(diǎn)，在細(xì)胞外完成基因連接，提高了載體構(gòu)建效率。本結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Ad-CRT的293LP細(xì)胞，CRT蛋白及基因表達(dá)水平均明顯高于轉(zhuǎn)染空載體及未轉(zhuǎn)染的293LP細(xì)胞，證實(shí)Ad-CRT的成功構(gòu)建及在體外有效表達(dá)，為進(jìn)一步開(kāi)展Ad-CRT抗腫瘤的體內(nèi)外研究實(shí)驗(yàn)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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R73

A

1005-9202(2012)12-2561-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.12.053

馬 萍(1960-)，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事分子腫瘤學(xué)研究。

趙 丹(1986-)，女，碩士，主要從事分子腫瘤學(xué)研究。

〔2011-05-30收稿 2011-09-20修回〕

(編輯 曹夢(mèng)園)