胡佳佳，惲時鋒，王 芳，范志宇，胡 波

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部動物疫病免疫與診斷重點開放實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014； 2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學科，江蘇 南京 210002）

支氣管敗血波氏桿菌（Bordetella bronchiseptica，Bb）是廣泛感染家畜、野生動物和實驗動物上呼吸道的一種革蘭氏陰性球桿菌，常引起家兔發(fā)生傳染性鼻炎和支氣管肺炎，更重要的是，Bb的先期感染易于導(dǎo)致其它多種細菌的繼發(fā)性感染，如多殺性巴氏桿菌、葡萄球菌等［1，2］，從而增加兔群呼吸道疾病的發(fā)病率和嚴重程度，同時也為 Bb的分離檢測增加了一定的難度。近年來，人們發(fā)現(xiàn)Bb可經(jīng)動物傳染給人，并在免疫功能缺陷或低下的人群（如AIDS患者）體內(nèi)形成嚴重感染［3-5］。因此，本病具有一定的公共衛(wèi)生意義。

目前，Bb的診斷方法主要是細菌學檢查、血清學凝集試驗、PCR檢測等，未找到引用源。而常規(guī)的細菌學檢查過程繁瑣、費時費力；血清學凝集試驗和PCR檢測方法常出現(xiàn)假陽性結(jié)果［7］，因此，建立一種快捷、高效、敏感、特異的檢測方法對本病的防控尤為重要。研究表明，百日咳桿菌粘附素（pertactin，PRN）是Bb最重要的粘附因子和抗原成分［8］，由prn基因編碼的一種具有保護性的自動轉(zhuǎn)運蛋白，屬于膜相關(guān)抗原，存在菌體外膜上，也存在于液體培養(yǎng)物上清中［9］，prn還可被病原菌利用以加強自身的附著作用［10］。本研究以臨床病例中分離的高毒力兔 Bb菌株（BJL0504）的基因組為模板，對 PRN基因進行了克隆、序列分析及原核表達，并將表達蛋白作為抗原，建立了檢測 Bb抗體的間接ELISA方法，為更好地防治本病奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌種和血清

兔支氣管敗血波氏桿菌株（BJL0504，相菌），由范志宇等分離鑒定并保存［11］；BL21（DE3）原核表達載體 pGEX-4T-1由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)所保存；兔支氣管敗血波氏桿菌陰、陽性血清自行制備并保存；綿羊血采自江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)所；待檢血清113份采自華東地區(qū)4個兔場。

1.2 主要試劑

BamH I、Xho I、TaqDNA聚合酶、蛋白酶 K和PCR回收純化試劑盒、IPTG等購自大連寶生物工程有限公司；GST融合蛋白純化柱購于 GE Healthcare；EB、瓊脂糖購于南京基天生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白（BSA）、酶標羊抗兔 IgG（HRPIgG）購自生物晶美公司；TMBS購自Amersco公司。

1.3 引物設(shè)計與 PCR擴增

參照GenBank公布的豬源支氣管敗血波氏桿菌 （Bordetella bronchiseptica）的 prn基 因 序 列（AY376325）針對上游和下游序列設(shè)計了一對特異性引物：

上游引物：5＇-GTGGATCCGACTGGAACAACC AGTCCATCATCA-3＇

下游引物：5＇-TTCTCGAGGTTGGCGATATAG GTGGCA-3＇

為了便于構(gòu)建表達載體，在上、下游引物5’端分別加入BamH I、Xho I酶切位點（引物中下劃線部分）。PCR擴增條件為：以Bb I相菌基因組為模板，進行PCR擴增，95℃ 預(yù)熱5 m in；94℃ 變性1 m in，61℃退火1 min，72℃延伸2.5 min，33個循環(huán)，72℃延伸7 min，冷卻至4℃ 保存。取 PCR擴增產(chǎn)物10 μL，進行1％ 瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍攝、分析結(jié)果。用凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物。

1.4 prn基因的克隆與鑒定

取PCR產(chǎn)物和原核表達載體pGEX-4T-1適量，用BamH I、Xho I酶消化，連接，轉(zhuǎn)化，得到重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-prn.將初選的陽性質(zhì)粒分別進行BamH I、Xho I雙酶切、PCR及測序鑒定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達與純化

重組表達載體 pGEX-4T-1-prn轉(zhuǎn)入 E.coli BL21（DE3）中。將含有陽性重組質(zhì)粒 pGEX-4T-1-prn和pGEX-4T-1空載體的E.coli BL21（DE3）單個菌落，分別接種于 3 mL LB（Amp+）液體培養(yǎng)基，37℃ 200 r/m in搖振培養(yǎng)2 h左右，使A600達到0.4～0.6。加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)表達6 h。取適量誘導(dǎo)表達后的細菌沉淀物經(jīng)超聲波裂解，加入含 8 mol/L尿素的 binding buffer進行充分溶解，然后按GST融合蛋白純化柱說明書進行純化。

1.6 重組蛋白的SDS-PAGE及Westernblot分析

按照文獻［12］介紹的方法進行重組蛋白的SDS-PAGE及Western blot分析，一抗為兔抗 Bb高免血清，二抗為HRP標記的羊抗兔IgG，按照DAB顯色液試劑盒顯色。

1.7 間接 ELISA檢測方法的建立

1.7.1 重組蛋白和待檢血清最佳工作濃度的確定：將純化后的重組蛋白 PRN用抗原包被液分別稀釋為1 000、500、250、125、62.5、31.25 ng/m L共6個梯度，100μL/孔，37℃孵育2 h，4℃過夜。次日棄去包被液，PBST洗滌5次拍干。用2％BSA封閉，200μL/孔，37℃封閉1.5 h。用血清稀釋液將陰、陽性血清分別作1∶20、1∶40、1∶80倍比稀釋，做ELISA方陣試驗，100μL/孔，37℃孵育1 h，確定抗原和血清的最適工作濃度。HRP-羊抗兔IgG做1：2000稀釋，100μL/孔，37℃孵育1h。新鮮配制的TMBS-H2O2底物顯色液，37℃避光顯色10 min。每孔50μL 2 mol/L H2SO4中止反應(yīng)，測定 A450值。比較陽性血清和陰性血清A450比值（P/ N），以確定合適的抗原包被濃度以及待測血清的最佳稀釋度。

1.7.2 判定標準的確定：取鑒定為Bb抗體陰性的50份兔血清，按照已經(jīng)確立的間接ELISA方法進行檢測。經(jīng)統(tǒng)計學分析，得到 A450平均值X和標準差S。根據(jù)統(tǒng)計學原理，A450值≥X+3S時，判為陽性。A450值≤X+2S者判為陰性，介于二者之間者判為可疑。

1.7.3 阻斷試驗：取5份波氏桿菌陽性血清作最佳稀釋，與等量重組蛋白抗原PRN（5μg/m L）混合，37℃作用2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，與未經(jīng)抗原處理的陰，陽性血清一起，同時作ELISA檢測。計算（N-P）/N值，若此值大于0.5，則判為阻斷陽性。

（N-P）/N=（未阻斷孔A值-阻斷孔A值）/未阻斷孔A值

1.7.4 重復(fù)性試驗：取6份陽性血清、3份陰性血清在不同時間相同條件下，重復(fù)檢測3次，觀察A450值的變化。

1.7.5 臨床應(yīng)用：用建立的間接 ELISA方法對采自華東地區(qū)4個兔場的113份血清進行檢測，初步評價應(yīng)用效果及兔場Bb感染情況。

2 結(jié)果

2.1 prn基因的擴增

以支氣管敗血波氏桿菌Ⅰ相菌（BJL0504）為模板進行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分析，在2 088 bp左右處有特異條帶，與預(yù)期大小相符（圖1）。

圖1 prn基因的PCR結(jié)果Note：M：DNA marker（DL2000），1：PCR products of prn geneFig.1 PCR products of prn gene

2.2 重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-prn的鑒定

使用引物對兩重組表達質(zhì)粒進行PCR擴增，在預(yù)期大小處得到了特異性條帶；進一步對其進行雙酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，得到與預(yù)期片段大小一致的特異條帶（圖2）；測序結(jié)果顯示，克隆的兔Bb prn基因序列與 GenBank公布的 4個豬源prn基因序列：AJ245927、AX418061、AY376325、BD409972相比，核苷酸同源性高達97.1％ 以上，說明成功構(gòu)建了目的片斷的重組表達質(zhì)粒pGEX-4T-1-prn。

2.3 SDS-PAGE及 Westernblot結(jié)果

表達的重組蛋白經(jīng)GST融合蛋白純化柱純化后，用12％ 的聚丙烯酰胺凝膠進行 SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明 pGEX-4T-1-prn在誘導(dǎo)后出現(xiàn)一條大小約為101 kDa的特異性蛋白條帶，與預(yù)期大小基本一致，命名為 PRN（圖3-3泳道），紫外分光光度計檢測純度為0.62 mg/m L。

圖2 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-prn的酶切鑒定Note：M：DNA marker（DL 2000，DL 15000）；1：Negative control；2：pGEX-4T-1-prn digested with BamHⅠand Xho I restriction enzyme.Fig.2 Identification of recombinant plasm idpGEX-4T-1-prn by enzyme digestion

Western blot顯示，DNT1融合蛋白在約101 kDa處出現(xiàn)很強的特異性反應(yīng)條帶（圖3-2泳道），質(zhì)粒 pGEX-4T-1誘導(dǎo)表達后在預(yù)期位置處無反應(yīng)條帶（圖3-4泳道），表明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達，并具有良好的反應(yīng)原性。

2.4 間接 ELISA檢測方法的建立

2.4.1 重組蛋白和待檢血清最佳工作濃度的確定：通過方陣滴定試驗，不同梯度陰、陽性血清和抗原的反應(yīng)結(jié)果見表1。確定重組蛋白PRN抗原和血清的最佳工作條件為：抗原最佳包被濃度為 500 ng/m L，血清最佳稀釋倍數(shù)為1/40。

圖3 表達產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果和Western blot分析Note：M：Protein marker；1，4：pGEX-4T-1 negative control； 2：Unpurified PRN expression products； 3：Purified PRN expression productsFig.3 Western blot（A）and SDS-PAGE（B）analyses of the expression products

2.4.2 結(jié)果判定：50份健康兔血清用建立的ELISA方法進行檢測。結(jié)果表明，重組蛋白PRN包被板的平均 A450值（x）為 0.109，標準差（SD）為0.062，臨界值X+3S=0.295。據(jù)此，確定血清樣品A450≤0.295，且P/N≤2.1，方可判為陽性；A450≤0.233為陰性；介于二者之間判為可疑。

2.4.3 阻斷實驗：重組蛋白 PRN抗原處理血清的阻斷抑制率為77.3％。證明重組蛋白PRN對血清抗體與包被抗原的結(jié)合有很強的抑制作用，包被抗原與血清抗體的結(jié)合是特異的。

2.4.4 重復(fù)性實驗：取同一批次重組蛋白抗原包被酶標板，在不同時間相同條件下檢測6份陽性血清，重復(fù)檢測3次，以結(jié)果判定為標準，檢測結(jié)果相同。

表1 重組蛋白 PRN和血清的不同稀釋度反應(yīng)結(jié)果Tab.1 Reaction results of the recombinant PRN protein and different serum dilutions

2.4.5 臨床應(yīng)用：用建立的間接EL ISA方法對采自華東地區(qū)幾個兔場的113份血清進行檢測。總陽性率為41.6％，這說明本地兔場Bb的感染率較高。

3 討論

PRN是由 p rn基因編碼的一種具有保護性的外膜蛋白成分，是 Bb感染重要的粘附因子［13］。有人在做豬的Bb感染試驗時發(fā)現(xiàn)不產(chǎn)生PRN的Bb菌株不能導(dǎo)致豬發(fā)生波氏菌病，且豬群的保護率與PRN抗體水平呈線性關(guān)系，因此 PRN被認為是 Bb最主要的保護性抗原［14，15］。此外，prn還具有對巨噬細胞的毒素作用，從而逃避宿主的免疫保護作用［9］。天然 PRN存在于菌體外膜上，分泌量非常有限，且純化工藝復(fù)雜，因此，本試驗借助原核表達系統(tǒng)進行克隆與體外表達PRN，并將其作為 ELISA包被抗原以檢測動物體內(nèi)特異的Bb抗體，從而診斷兔群是否發(fā)生了波氏桿菌病。

以自行分離的兔源Bb的基因組為模板進行克隆，克隆出的 p rn基因通過核苷酸和氨基酸序列比對，發(fā)現(xiàn)與GenBank公布的4個豬源PRN基因序列相比，同源性高達97.1％，表明 p rn基因是非常保守的，可考慮作為兔波氏桿菌病的檢測抗原和亞單位疫苗研究的候選基因。從融合蛋白的理化特性看，該蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定蛋白質(zhì)［16］，具備了作為基因工程抗原的理化條件。SDSPAGE結(jié)果表明，純化的重組蛋白 PRN純度不是很高，但以其作為包被抗原建立的Bb抗體檢測的間接 ELISA方法重復(fù)性特異性和敏感性良好，分析其原因可能是：（1）表達產(chǎn)物理化特性穩(wěn)定，受環(huán)境影響小，易于保持抗原活性；（2）重組蛋白表達量高，反應(yīng)原性好，從而降低了非特異性反應(yīng)。Western blot分析可見，目的帶處呈現(xiàn)明顯的條帶而未見明顯的非特異性條帶，說明表達產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性和特異性，這是本方法成功建立的關(guān)鍵。并且該基因在大腸桿菌中獲得大量表達，為進一步開發(fā)為診斷試劑抗原奠定基礎(chǔ)。用建立的 ELISA方法對華東地區(qū)4個兔場進行監(jiān)測，113份血清樣品的總陽性率為41.6％，這說明華東地區(qū)兔場 Bb的感染率較高。應(yīng)引起高度關(guān)注。

本方法的建立，克服了細菌分離鑒定較為繁瑣費時和 PCR檢測易出現(xiàn)假陽性的缺點；此外，包被抗原易于純化，ELISA操作方法簡單。因此，本研究建立的新方法，有望成為一種準確、快速和實用的兔Bb病血清學診斷方法。

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