黃 莉 黃純蘭

（瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 瀘州 646000）

近年來研究發(fā)現(xiàn)威靈仙中的有效成分三萜皂苷［1］可以通過誘導(dǎo)惡性腫瘤細胞的分化和凋亡達到抗腫瘤作用［2-3］，筆者在前期研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷對NB4細胞具有誘導(dǎo)凋亡作用［4］，但是對NB4細胞是否具有誘導(dǎo)分化作用尚無研究。因此，本研究擬從細胞的增殖抑制、形態(tài)變化和功能抗原表達等方面研究威靈仙總皂苷對急性早幼粒細胞白血病NB4細胞是否具有誘導(dǎo)分化作用，以期為進一步研究威靈仙在血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床治療上的應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 威靈仙總皂苷由瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院參照文獻［5-7］提取，系棕色粉末狀結(jié)晶，儲存液 （16 mg/mL）用無血清RPMI1640（Gibeo公司產(chǎn)品）溶解，應(yīng)用液用含10%小牛血清的RPMI配制；佛波醇酯（TPA）、硝基藍四氮唑（NBT）、全反式維甲酸（ATRA）干粉為美國Sigma產(chǎn)品；CD11b和CD33購自BD公司。

1.2 細胞培養(yǎng) NB4細胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)院干細胞生物研究室饋贈。將NB4細胞接種于含體積分數(shù)為10%小牛血清、青霉素100 IU/mL及鏈霉素100 μg/mL的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的孵箱中懸浮培養(yǎng)。取對數(shù)生長期，臺盼藍染色拒染率在95%以上的細胞進行實驗。

1.3 細胞增殖率和形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期的NB4細胞，以1×105/mL細胞密度分別接種于含5種不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷（分別為 25、50、100、200、400 μg/mL）的培養(yǎng)液中，并設(shè)不加藥空白對照組和1 μmol/L ATRA陽性對照組，培養(yǎng)體系8 mL，連續(xù)培養(yǎng)5 d。每日取各組細胞，記數(shù)活細胞，繪制生長曲線，并計算第5日的生長抑制率。隔日取各濃度組細胞，離心涂片瑞氏染色后油鏡下觀察200個細胞形態(tài)變化并計算細胞誘導(dǎo)分化率，誘導(dǎo)分化率（%）=（200-早幼粒細胞）/200×100%。

1.4 硝基藍四氮唑 （NBT）還原實驗 取各實驗組細胞懸液500 μL，與1 g/L的NBT溶液混合，加入200 μg/mL TPA溶液100 μL，37℃孵育30 min后離心涂片，光鏡下見胞漿內(nèi)含藍黑色顆粒的為陽性細胞。計數(shù)200個細胞，得出NBT陽性細胞的百分率。實驗重復(fù)3次。

1.5 透射電鏡觀察 收集第4日各實驗組的細胞，離心，PBS洗滌，戊二醛固定，按常規(guī)制備超薄切片，在透射電鏡下觀察細胞核、染色質(zhì)等的變化并照相。

1.6 細胞分化表面抗原CD11b和CD33的檢測 取經(jīng)威靈仙總皂苷作用后的細胞，用CD11b和CD33單抗對各組細胞進行免疫標記，用流式細胞儀檢測細胞表面抗原表達（平均熒光強度）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（表示，各組應(yīng)用方差分析。率的比較采用χ2檢驗。以a＝0.05為檢驗水準。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 威靈仙總皂苷對NB4細胞生長的影響 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用NB4細胞后，隨著劑量增加和作用時間延長，細胞增殖明顯受抑，呈現(xiàn)劑量和時間的量效關(guān)系。在96 h時出現(xiàn)抑制率的最高值。但在120 h，威靈仙總皂苷各組受抑率整體出現(xiàn)輕度下降。400 μg/mL組的抑制率變化幅度在各組中最大，96 h生長抑制率達到（37.41±2.16）%，與陽性對照組比較沒有明顯差異（P＞0.05）。 見表 1。

表1 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷在各時間點對NB4細胞生長的抑制率（%，

表1 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷在各時間點對NB4細胞生長的抑制率（%，

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2.2 威靈仙總皂苷對NB4細胞細胞形態(tài)及細胞分化率的影響與空白對照組相比，威靈仙總皂苷組在整個實驗中未見典型分化作用，僅個別細胞核出現(xiàn)腎形或桿核。卻出現(xiàn)了明顯的核固縮、核邊聚、核碎裂、胞膜出泡現(xiàn)象，并可見典型的凋亡小體。隨濃度增高，時間延長，該現(xiàn)象越明顯。而陽性對照組，細胞體積變小，胞漿增多，核縮小，核漿比例減少，細胞核由圓、橢圓轉(zhuǎn)變?yōu)槟I形、桿狀，甚至出現(xiàn)分葉。見圖1，表2。

表2 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用96 h后對NB4細胞分化和形態(tài)的影響

表2 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用96 h后對NB4細胞分化和形態(tài)的影響

與空白對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

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圖1 威靈仙總皂苷400 μg/mL組72 h后NB4細胞形態(tài)（Wright's-Giemsa染色，×1000）

2.3 NBT還原實驗結(jié)果 威靈仙總皂苷各濃度組作用于NB4細胞5 d后，NBT還原法檢測結(jié)果顯示，各實驗濃度組細胞內(nèi)無或者僅有少量的藍色顆粒，隨濃度和時間的變化，NBT陽性率無明顯增加，與空白對照組比較無顯著差異（P＞0.05），明顯低于陽性對照組（P＜0.01）。見表3。

表3 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷對NB4細胞NBT還原率的影響

表3 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷對NB4細胞NBT還原率的影響

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2.4 透射電鏡 與Wright's-Giemsa染色的細胞形態(tài)學(xué)改變類似，實驗組經(jīng)威靈仙總皂苷作用96 h后，在透射電鏡下并未發(fā)現(xiàn)有較明顯的胞漿、胞核成熟現(xiàn)象，僅個別細胞出現(xiàn)桿核或者腎形核改變。但是觀察到NB4細胞明顯呈現(xiàn)凋亡形態(tài)學(xué)變化：胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚并邊集呈月牙狀改變，核仁消失。見圖2。

圖2 威靈仙總皂苷400 μg/mL作用96 h后NB4細胞電鏡圖

2.5 細胞表面分化抗原CD11b、CD33的檢測 1 μmol/L ATRA作用NB4細胞后，可明顯使CD11b表達增加（P＜0.01），CD33表達下降。而威靈仙總皂苷各劑量組CD11b表達的陽性率低，CD33表達無明顯下降，與空白對照組比較無顯著差異 （P＞0.05）。 見圖 3，表 4。

表4 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用于NB4細胞72 h 后CD11b、CD33 表達（n=3

表4 不同質(zhì)量濃度威靈仙總皂苷作用于NB4細胞72 h 后CD11b、CD33 表達（n=3

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圖3 不同劑量威靈仙總皂苷作用NB4細胞72h后CD11b、CD33的表達

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)威靈仙總皂苷對NB4細胞增殖有明顯的抑制作用，隨著作用質(zhì)量濃度增大、作用時間增長，細胞增殖率明顯降低，抑制率明顯增高，呈現(xiàn)劑量和時間的量效關(guān)系。該結(jié)果與我們前期報道一致，與文獻報道亦相符合［4］。在120 h所有實驗組的抑制率出現(xiàn)整體輕度下降，根據(jù)120 h陰性對照組臺盼藍拒染率的明顯下降，分析可能與在實驗后期細胞死亡率增加有關(guān)。

NB4細胞在被誘導(dǎo)向正常細胞方向分化成熟過程中，逐漸獲得吞噬能力，細胞糖代謝活躍。在TPA的激發(fā)下，細胞內(nèi)超氧陰離子產(chǎn)生增多，中間代謝產(chǎn)物大量脫氫，所脫的氫能將無色染料NBT還原沉淀于胞質(zhì)內(nèi)，呈現(xiàn)藍黑色顆粒沉著于細胞內(nèi)有酶活性的部位，顯微鏡下可見陽性細胞有著色斑。這種細胞即為NBT還原陽性細胞，是細胞分化成熟的重要標志。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的威靈仙總皂苷作用NB4細胞后，細胞內(nèi)無或者僅有少量的藍色顆粒，但數(shù)量明顯低于維甲酸誘導(dǎo)的陽性對照組，隨著威靈仙總皂苷劑量的增加，NBT陽性率無明顯增加，由此提示威靈仙總皂苷誘導(dǎo)分化作用不明顯。同樣，在透射電鏡檢測中發(fā)現(xiàn)，威靈仙總皂苷組干預(yù)后細胞并未出現(xiàn)較明顯的胞漿、胞核成熟現(xiàn)象，但是卻觀察到NB4細胞呈現(xiàn)胞膜皺縮、染色質(zhì)凝聚并邊集呈月牙狀改變，核仁消失等凋亡形態(tài)學(xué)變化。然而，在誘導(dǎo)分化實驗中，細胞形態(tài)改變不一定典型，而且一些早期前體細胞缺乏形態(tài)學(xué)和生物學(xué)的特征，因而單憑形態(tài)學(xué)判斷有一定的困難?，F(xiàn)已知，隨著白血病細胞分化，細胞膜表面某些蛋白抗原也相應(yīng)發(fā)生改變，根據(jù)抗原表達可較精確地判斷試驗細胞所處的分化階段。CD33抗原是早期粒細胞的標志，90%AML患者的白血病細胞表達CD33抗原，其表達降低可作為細胞分化成熟的標志之一。CD11b抗原是細胞成熟分化的另一標志，早幼及早中幼粒細胞表面不表達CD11b，而隨著細胞分化成熟為各期粒細胞以及成熟單核細胞，CD11b表達陽性率逐漸升高［8］，近年來已經(jīng)把CD11b作為髓系白血病分化的重要標志。本研究采用流式細胞儀檢測兩種抗原的表達，其結(jié)果與鏡下觀測一致，NB4細胞經(jīng)各劑量威靈仙總皂苷處理后，細胞表面的CD33未隨時間和濃度的變化出現(xiàn)下降趨勢，而CD11b也未隨著時間和劑量的變化而表達增加。CD33、CD11b的表達與空白對照組相比無明顯差異，而ARTA組可以顯著提高NB4細胞CD11b的表達并誘導(dǎo)CD33抗原表達降低。流式法檢測兩種抗原表達結(jié)果與鏡下觀測一致。因此，通過本實驗以及前期觀察，威靈仙總皂苷各質(zhì)量濃度組對急性早幼粒細胞白血病NB4細胞無明顯的誘導(dǎo)分化作用。產(chǎn)生明顯的增殖抑制作用的原因可能系誘導(dǎo)NB4發(fā)生凋亡為主。至于威靈仙總皂苷如何誘導(dǎo)細胞凋亡以及發(fā)生凋亡的機制有待進一步研究探討。

［1］ 吳壽金，趙泰，秦永祺.現(xiàn)代中草藥成分化學(xué)［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2002：486.

［2］ 趙燕強，楊立新，張憲民，等.威靈仙的成分、藥理活性和臨床應(yīng)用的研究進展［J］.中藥材，2008，31（3）：465.

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