吳 柯， 萬立華， 謝靈瑤， 楊俊卿△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，重慶400016)

有研究證明鋁鹽負(fù)荷是成熟的神經(jīng)元損傷模型之一［1－2］，另一方面，環(huán)氧化酶 2(cyclooxygenase 2，COX －2)的表達(dá)增加與包括外傷性腦損傷［3］、腦缺血［4］、阿爾茨海默病(Alzheimer disease)［5］等神經(jīng)病理密切相關(guān)。正如大家所熟知，神經(jīng)元的損傷和慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)回路甚至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能失調(diào)，那么在炎癥或損傷過程中扮演著關(guān)鍵角色的COX－2在海馬、皮層神經(jīng)元呈現(xiàn)的高表達(dá)［6］對(duì)于神經(jīng)元有明顯的致?lián)p傷何作用，具體機(jī)制仍待探討。本實(shí)驗(yàn)以RNA干擾為手段，以鋁負(fù)荷致大鼠海馬神經(jīng)元損傷為模型，初步探討了COX－2表達(dá)與神經(jīng)元損傷的關(guān)系。

材料和方法

1 動(dòng)物、細(xì)胞株和主要試劑

新生24 h內(nèi)SD大鼠，重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(渝)2007001;293細(xì)胞株和COX－2特異性干擾重組腺病毒由重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)系提供;六水三氯化鋁購于國藥化工試劑有限公司;B27購于Gibco;左旋多聚賴氨酸和MTT購于Sigma;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購于Pierce;COX－2Ⅰ抗購于Santa Cruz。

2 方法

2.1 大鼠海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng) 參照Choi等［7］方法，出生24 h內(nèi)SD乳鼠，用75%乙醇消毒后，斷頭。超凈臺(tái)分離海馬，盡量剔除結(jié)締組織和血管，并將組織盡量剪碎，加組織體積5倍的0.125%胰酶消化。250目尼龍網(wǎng)過濾，得到的細(xì)胞懸液，800 r/min離心8 min。2次離心后，臺(tái)盼藍(lán)法對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行活細(xì)胞記數(shù)。計(jì)算細(xì)胞存活率(＞95%)并將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106cells/L的細(xì)胞懸液，種植于賴氨酸處理的24孔板或96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀測(cè)24 h神經(jīng)元貼壁后，換B27無血清維持培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，每2 d半量換液1次。

2.2 293細(xì)胞培養(yǎng)，腺病毒的擴(kuò)增及滴度的測(cè)定 于100 mL培養(yǎng)瓶中種植狀態(tài)良好的293細(xì)胞，生長(zhǎng)至80%融合即用于擴(kuò)增腺病毒。將1.5 mL腺病毒原液加入到4 mL 10%DEME完全培養(yǎng)液中充分混勻，再加入到PBS洗過的80%融合的293細(xì)胞中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。熒光觀察病毒感染率及倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)到明顯熒光且細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE時(shí)即到達(dá)收病毒時(shí)間。3 000 r/min離心，0.5 mL培養(yǎng)液吹散細(xì)胞沉淀，37℃至－80℃反復(fù)凍融4次，8 000 r/min低溫離心15 min，收集上清液即為擴(kuò)增好的腺病毒。參照江千里等［8］的方法，進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定。病毒滴度(U/L)=103U×計(jì)數(shù)孔相對(duì)于第1孔的稀釋倍數(shù)/第1孔加入病毒的體積，即1×10(n+4)U/L，n=計(jì)數(shù)孔。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 正常大鼠神經(jīng)元培養(yǎng)至第7 d，分成空載腺病毒組、COX－2特異性干擾腺病毒組、鋁+空載腺病毒組、鋁+COX－2特異性干擾腺病毒組?？蛰d組加入感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為100的空載病毒量，COX－2特異性干擾腺病毒組加入MOI為100的COX－2特異性干擾病毒量;鋁+空載腺病毒組全量換液成200 μmol·L－1AlCl3培養(yǎng)液，同時(shí)加入MOI為100的空載病毒量，鋁+COX－2特異性干擾腺病毒組全量換液成200 μmol·L－1AlCl3培養(yǎng)液，同時(shí)加入MOI為100的COX－2特異性干擾病毒量。作用24 h后進(jìn)行MTT、生化檢測(cè)、熒光細(xì)胞觀察和蛋白提取。

2.4 Western blotting檢測(cè)海馬神經(jīng)元COX－2蛋白表達(dá)收集經(jīng)干預(yù)處理24 h后的細(xì)胞，裂解20 min。用Bradford法測(cè)定裂解液中總蛋白含量。取細(xì)胞裂解液上樣于SDSPAGE聚丙烯酰胺凝膠，每孔50 μg蛋白電泳。電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。加入封閉液過夜，抗靶蛋白抗體溶液與濾膜一同室溫孵育2～3 h，洗膜，加入Ⅱ抗工作液室溫孵育1 h，洗膜，檢測(cè)靶蛋白的表達(dá)。

2.5 SOD活性和MDA含量測(cè)定 大鼠海馬神經(jīng)元在24孔板中培養(yǎng)至7 d，胰酶消化后，低溫超聲破碎細(xì)胞，收集上清液0.2 mL，按照SOD和MDA試劑盒說明書，分別在550 nm和532 nm處測(cè)各管吸光度(absorbance，A)。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

SOD活性［103U·(g protein)－1］=(對(duì)照管A值－測(cè)定管A值)/對(duì)照管A值/50% ×反應(yīng)液總體積/取樣量(mL)/蛋白含量(g·L－1)。MDA［μmol·(g protein)－1］=(測(cè)定管A值－測(cè)定空白管A值)/(標(biāo)準(zhǔn)管A值－標(biāo)準(zhǔn)空白管A值)×10 μmol·L－1÷蛋白濃度(g·L－1)。

2.6 LDH測(cè)定 收集各組培養(yǎng)液上清0.06 mL(設(shè)為A溶液)。胰酶消化各組細(xì)胞，超聲波破碎細(xì)胞，低溫離心收集上清液0.06 mL(設(shè)為B溶液)。參照LDH測(cè)定試劑盒說明書，于440 nm處測(cè)各管A值。蛋白定量采用考馬斯亮藍(lán)法。

LDH活性［U·(g protein)－1］=測(cè)定管A值－測(cè)定空白管A值/標(biāo)準(zhǔn)管A值－標(biāo)準(zhǔn)空白管A值×2 mmol·L－1÷蛋白濃度(g·L－1)，LDH漏出率=A/(A+B)×100%。

2.7 MTT測(cè)定 大鼠海馬神經(jīng)元接種于96孔板，分組及干預(yù)同“2.3”方法，24 h后，每孔加入 5 g·L－1MTT溶液 20 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，除上清，加150 μL DMSO(二甲基亞砜)振蕩以溶解結(jié)晶。于570 nm波長(zhǎng)處讀取A值。

2.8 神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)熒光觀察 腺病毒轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元24 h后，熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 腺病毒滴度

測(cè)得COX－2特異性干擾腺病毒滴度=1012U/L，RFP空載腺病毒滴度=1012U/L，然后根據(jù)下列公式計(jì)算轉(zhuǎn)染神經(jīng)元需要加入的病毒量:

MOI=病毒滴度×V(需加入的病毒液體積)/神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)，即當(dāng) MOI=100 時(shí)，V=100 μL。

2 COX-2特異性干擾對(duì)海馬神經(jīng)元COX－2蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，單純RNAi組的COX－2蛋白水平明顯低于空載組。鋁+空載腺病毒組COX－2蛋白水平明顯增加，而RNAi+鋁鹽組COX－2蛋白水平明顯下降，見圖1。

Figure 1.Changes of COX－2 protein expression in primary cultured rat hippocampal neurons.1:vector － treated group;2:COX－2 RNAi－treated group;3:vector and aluminum－treated(Al+vector)group;4:COX－2 RNAi and aluminum－treated(Al+COX－2 RNAi)group.±s.n=3.＊＊P＜0.01 vs vector group;##P ＜0.01 vs Al+vector group.圖1 COX－2 RNA干擾對(duì)海馬神經(jīng)元COX－2蛋白表達(dá)的影響

3 COX-2干擾對(duì)海馬神經(jīng)元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率及神經(jīng)元活性的影響

與空載組相比，單純RNAi組SOD活性無顯著改變，而鋁+空載腺病毒組SOD活性顯著降低，COX－2 RNAi+鋁鹽組的SOD活性顯著升高，見表1。

與空載組相比，單純RNAi組MDA含量無顯著改變，而鋁+空載腺病毒組MDA含量顯著增加，COX－2 RNAi+鋁鹽組的MDA含量明顯下降，見表1。

與空載組相比，單純RNAi組LDH漏出率無顯著差異，而鋁+空載腺病毒組LDH漏出率明顯增加;與鋁+空載腺病毒組相比，RNAi組LDH漏出率明顯降低，見表1。

正常神經(jīng)元RNAi組與空載組相比，MTT測(cè)定的吸光度值無顯著差異;鋁+空載腺病毒組MTT值明顯降低，COX－2 RNAi+鋁鹽組MTT值明顯上升，見表1。

4 COX-2干擾對(duì)海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)的影響

轉(zhuǎn)染空載腺病毒的海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清楚完整，胞體飽滿且胞核清晰，突觸較長(zhǎng)，并且相互連結(jié)形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞數(shù)目較多。轉(zhuǎn)染COX－2 RNA干擾片段進(jìn)入正常的海馬神經(jīng)元中，細(xì)胞結(jié)構(gòu)依舊完整，細(xì)胞數(shù)量多，提示單純 COX－2 RNA干擾對(duì)神經(jīng)元無明顯損傷作用。

表1COX－2干擾對(duì)海馬神經(jīng)元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率和MTT的影響Table 1.Changes of SOD，MDA，LDH and MTT in primary cultured rat hippocampal neuron(±s.n=6)

表1COX－2干擾對(duì)海馬神經(jīng)元SOD活性、MDA含量、LDH漏出率和MTT的影響Table 1.Changes of SOD，MDA，LDH and MTT in primary cultured rat hippocampal neuron(±s.n=6)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs vector－treated group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs vector and aluminium －treated group.

value Vector－ treated 83.83 ±6.00 2.20 ±0.45 18.03 ±Group SOD［103U·(g protein)－1］MDA［μmol·(g proein)－1］LDH(%) A 3.81 0.779 ±0.080 COX －2 RNAi 84.08 ±4.50 2.85 ±0.34 20.20 ±2.43 0.768 ±0.100 Vector and aluminium －treated 46.38 ±4.04＊＊ 4.20 ±0.590＊＊ 39.68 ±4.82 ＊＊ 0.508 ±0.060*COX －2 RNAi and aluminium － treated 70.50 ±2.65## 3.27 ±0.27# 23.38 ±3.50## 0.600 ±0.060#

鋁+空載腺病毒組海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，且突起萎縮明顯，并伴有部分死細(xì)胞。而轉(zhuǎn)染了COX－2RNA干擾片段后，神經(jīng)元突起較為明顯，且能相互連接成網(wǎng)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也較為清楚，死細(xì)胞較少，見圖2。

Figure 2.Effects of COX －2 RNAi on pathomorphology in primary cultured rat hippocampal neurons(×200).A:vector group;B:COX－2 RNAi group;C:Al+vector group;D:Al+COX－2 RNAi group.圖2 COX-2 RNA干擾對(duì)海馬神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)的影響

討 論

目前，鋁元素公認(rèn)可在大腦誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量自由基，從而誘發(fā)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生和發(fā)展。許多學(xué)者采用鋁鹽進(jìn)行造模，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)鋁鹽會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和退變，并發(fā)現(xiàn)動(dòng)物出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶功能障礙，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，DNA損傷等表現(xiàn)［9－12］。大量研究成果也表明COX－2的表達(dá)與腦損傷、神經(jīng)元退變密切相關(guān)。AD患者腦內(nèi)Aβ淀粉樣物質(zhì)水平與COX－2表達(dá)的增加具有一致性，臨床上發(fā)現(xiàn)AD患者神經(jīng)纖維纏結(jié)的神經(jīng)元亦是COX－2表達(dá)增加的部位，提示COX－2的過表達(dá)可能是造成神經(jīng)元死亡的原因之一［13－14］。進(jìn)一步研究還提示 COX－2高表達(dá)是誘導(dǎo)Aβ淀粉樣物質(zhì)增加的因素之一［15］，在經(jīng)典的鋁鹽過負(fù)荷導(dǎo)致神經(jīng)元損傷、退變的模型下，探究COX－2起著怎樣的作用及其之間可能的內(nèi)在聯(lián)系必然會(huì)為治療神經(jīng)損傷和退行性變疾病開拓新的思路，并為開發(fā)新的藥物提供可能的理論依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與空載腺病毒組相比，單純COX－2 RNAi腺病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元其各項(xiàng)生化酶學(xué)指標(biāo)無明顯的變化，神經(jīng)元數(shù)目正常，細(xì)胞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，且胞體飽滿，胞核清晰。而Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，其COX－2蛋白表達(dá)明顯下降(P＜0.01)，一方面提示COX－2 RNAi腺病毒的轉(zhuǎn)染神經(jīng)元是成功的;另一方面，提示RNAi使海馬神經(jīng)元COX－2的表達(dá)適度沉默，并不明顯影響海馬神經(jīng)元形態(tài)和生理功能。我們還發(fā)現(xiàn)，COX－2 RNAi能明顯提高鋁鹽負(fù)荷海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活力和 SOD活性(P＜0.05或 P＜0.01)，降低細(xì)胞LDH漏出率和MDA含量(P＜0.05或P＜0.01)，從而減輕了細(xì)胞損傷，并一定程度改善鋁負(fù)荷神經(jīng)元病理形態(tài)學(xué)改變。結(jié)果表明，COX－2在神經(jīng)組織中過表達(dá)可能損傷神經(jīng)元，COX－2 RNA干擾對(duì)神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用。

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