周春炎 周昌龍 關(guān)偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，如皋 226500）

豬瘟、高致病性豬藍(lán)耳病和口蹄疫疫苗免疫試驗(yàn)報(bào)告

周春炎 周昌龍 關(guān)偉偉

（江蘇省如皋市畜牧獸醫(yī)站，如皋 226500）

豬瘟俗稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科豬瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種急性、發(fā)熱、接觸性傳染的傳染病。具有高度傳染性和致死性。高致病性豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍(lán)耳?。┎《咀儺愐鸬囊环N急性高致死性疫病。仔豬發(fā)病率可達(dá)100%、死亡率可達(dá)50%以上，母豬流產(chǎn)率可達(dá)30%以上，育肥豬可發(fā)病死亡。這2個(gè)傳染病的臨床癥狀、病理變化有相似之處，不易區(qū)分。為尋求最佳免疫方案，本實(shí)驗(yàn)研究采用2病疫苗的不同劑量、不同疫苗品種、不同疫苗組合等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)，進(jìn)行免疫抗體檢測(cè)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 疫苗

1.1.1.1 豬口蹄疫O型滅活疫苗（O/MYA98/BY/2010株）（WA）批號(hào)：H110206J 規(guī)格：100ml/瓶 廠家：××生物科技股份有限公司；口蹄疫O型滅活疫苗（OZK/93株+OR/80株）（WB）批號(hào)：0132059 規(guī)格：50 ml/瓶 廠家：××生物藥品有限公司。

1.1.1.2 豬瘟活疫苗（細(xì)胞源）（CSFV）批號(hào)：101005 規(guī)格：20頭份/瓶 廠家：××生物股份有限公司。

1.1.1.3 豬藍(lán)耳活疫苗批號(hào)：1011099-2規(guī)格：20頭份/瓶 廠家：××股份有限公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器和試劑 采血器，注射器，酶標(biāo)儀，生化培養(yǎng)箱，微量加樣器等，O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒，豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒，ELISA豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)豬 如皋某生豬養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 免疫程序 各實(shí)驗(yàn)組于19日齡免疫豬藍(lán)耳活疫苗2頭份，具體免疫情況詳見(jiàn)表1。

1.2.2 血樣采集 5組實(shí)驗(yàn)豬，分別在27、57、87、118、149日齡采集血樣，每次4 ml。27、57日齡免疫前采血樣。

1.2.3 抗體免疫效果檢測(cè) 采用ELISA的方法進(jìn)行免疫效果監(jiān)測(cè)。豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒廠家：北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，批號(hào)：43220-V731。LSI豬繁殖和呼吸綜合征抗體檢測(cè)試劑盒廠家：北京天之泰生物科技有限公司 批號(hào)：5-VETPRA-012。

具體操作如下：

1.2.3.1 豬瘟抗體檢測(cè)

1.2.3.1.1 加樣 每個(gè)檢測(cè)孔分別加入50 μl樣品稀釋液，分別將50 μl陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照加入到相應(yīng)的對(duì)照孔中，注意不同對(duì)照的吸頭需要更換，分別將50 μl被檢樣品加入到剩余的檢測(cè)孔中，注意更換吸頭；

1.2.3.1.2 孵育 將微量反應(yīng)板用振蕩器振蕩，混勻反應(yīng)板中的溶液，與室溫下（18℃～25℃）孵育2 h，注意封板或置于濕盒中，避免液體揮發(fā)。

1.2.3.1.3 用300 μl洗滌液連續(xù)洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.1.4 加入100 μl辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，封板，室溫溫育30 min。

1.2.3.1.5 同上。洗板3次，甩干。每孔加100 μl底物溶液，避光、室溫下溫育10 min。

1.2.3.1.6 每孔加入終止液100 μl，混勻；立即置波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀，讀取OD值。

1.2.3.2 豬藍(lán)耳病抗體檢測(cè)

1.2.3.2.1 用樣品稀釋液將樣品進(jìn)行200倍稀釋，先吸取5 μl的樣品加入95 μl樣品稀釋液中，混勻，再吸取5 μl稀釋了20倍的液體加入ELISA反應(yīng)板孔，再加入45 μl的樣品稀釋液；

表1 各實(shí)驗(yàn)組免疫情況一覽表

1.2.3.2.2 分別將50 μl陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照、及200倍稀釋的樣品在反應(yīng)板孔。

1.2.3.2.3 蓋上膜，在37℃作用60 min。

1.2.3.2.4 去膜，用300 μl洗滌液連續(xù)洗ELISA板3次，在吸水紙上甩干。

1.2.3.2.5 加入50 μl酶標(biāo)抗體，封板，37℃溫育60 min。

1.2.3.2.7 同上洗板3次，甩干。每孔加50 μl底物溶液，避光、20℃～25℃下溫育10 min。

1.2.3.2.8 每孔加入終止液50 μl，混勻；立即置波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀，讀取OD值。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

開(kāi)展豬藍(lán)耳病、豬瘟、口蹄疫等疫苗免疫注射后，1周內(nèi)臨床觀察全部實(shí)驗(yàn)豬均無(wú)疫苗反應(yīng)出現(xiàn)。后期出現(xiàn)5頭生豬死亡，通過(guò)養(yǎng)殖場(chǎng)技術(shù)人員發(fā)病前的觀察及死亡后解剖診斷為腸炎和胸膜肺炎，與疫苗無(wú)關(guān)。

2.2 抗體檢測(cè)

2.2.1 豬瘟抗體

豬瘟陰陽(yáng)性的判斷：豬瘟陰陽(yáng)性于OD值成反比。大于臨界OD值判為陰性，且隨著OD值得升高，陰性抗體滴度越低；小于臨界OD值判為陽(yáng)性，且隨著OD值得降低，陽(yáng)性抗體滴度越高。

從表3可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)的豬群在經(jīng)豬瘟免疫后抗體陽(yáng)性率均有不同程度上升，對(duì)比5個(gè)組的抗體陽(yáng)性率可見(jiàn)，C組的陽(yáng)性率呈直線上升，到第4次所采樣中陽(yáng)性率達(dá)100%。A、B、D、E4個(gè)組的與其比較，在前3次采樣中除B組陽(yáng)性率高于C組外，其他均低于C組，到第4、第5次采樣后陽(yáng)性率全都低于C組。其中，D組第1次采樣所測(cè)抗體為母源抗體陽(yáng)性率達(dá)90.91%，在進(jìn)行1次豬瘟免疫后在第2次免疫前采樣所測(cè)抗體陽(yáng)性率降為0%，再見(jiàn)過(guò)2次免疫后抗體陽(yáng)性率才有所上升。總之，C組豬瘟免疫方案從免疫效果看出，可值得推廣；母源抗體高的個(gè)體在免疫后會(huì)產(chǎn)生一些中和，促使抗體下降，保護(hù)率下降，這就要求在疫苗免疫之前做好抗體檢測(cè)對(duì)后期疫苗的防疫有著直接的指導(dǎo)意義。

從圖4可以看出，實(shí)驗(yàn)A組豬瘟第1次到第2次采樣OD值有所升高，是由于母源抗體因素，產(chǎn)生中和，導(dǎo)致抗體滴度降低；在第2次免疫之后，到第3次、第4采樣后所測(cè)OD值大部分均呈下降趨勢(shì)，到第5次采樣所測(cè)OD值大部分呈反彈趨勢(shì)，表示抗體滴度在降低，保護(hù)率有所下降。

由圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)C組豬瘟第1次到第2次采樣OD值下降，明顯可見(jiàn)所測(cè)母源抗體OD值比較高，即抗體滴度低，與免疫抗原產(chǎn)生的反應(yīng)小，隨著疫苗在體內(nèi)刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體到第2～第4次采樣后所測(cè)OD值呈下降，到第5次采樣所測(cè)OD值成上升趨勢(shì)，是由于免疫后隨著時(shí)間的推移，機(jī)體內(nèi)的抗體滴度有所下降。

圖2 豬瘟純陽(yáng)性率

圖3 豬瘟抗體OD值

圖4 C組豬瘟抗體OD值

2.2.2 高致病性藍(lán)耳病抗體檢測(cè)

本次實(shí)驗(yàn)豬在19日齡全部免疫2頭份豬藍(lán)耳病活疫苗1次，在27、57、87、118、149日齡采血樣進(jìn)行抗體檢測(cè)。該檢測(cè)利用特異的PRRS被包被在96孔板上，在反應(yīng)過(guò)程中，檢測(cè)樣本被加入反應(yīng)孔中，樣本中的特異性抗體會(huì)與孔中包被的特異性抗原反應(yīng)，在洗板的過(guò)程中不會(huì)被清洗掉，當(dāng)添加酶標(biāo)復(fù)合物時(shí)，這些酶標(biāo)復(fù)合物就會(huì)與豬的抗體發(fā)生反應(yīng)。沒(méi)有結(jié)合的酶標(biāo)復(fù)合物在洗板的過(guò)程中被清洗。在加入對(duì)氧化酶敏感的可以顯色底物。顯色的顏色深淺與樣本所含PRRS的抗體濃度成正比。抗體陰陽(yáng)性界定以臨界值為界，低于該臨界值為陽(yáng)性，低于臨界值為陰性，個(gè)體抗體滴度與所測(cè)OD值成正比。

從圖6可以看出，C、D組PRRS抗體滴度隨著時(shí)間的推移到第4次采樣所測(cè)OD值均呈上升趨勢(shì)，到第5次部分呈下降，分析由于免疫后時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，抗體有所下降?？梢?jiàn)PRRS的免疫超過(guò)一定時(shí)間必須加強(qiáng)免疫1次，每次間隔時(shí)間大約為4個(gè)月左右。

本試驗(yàn)報(bào)告基于2011年江蘇省農(nóng)業(yè)三項(xiàng)工程，項(xiàng)目編號(hào)：sx（2011）181。

項(xiàng)目名稱：生豬口蹄疫O型疫苗（O/MAY98/BY/2010株）免疫試驗(yàn)與推廣。