蘇愛(ài)華，叢 喆，王 衛(wèi)，陳 霆，魏 強(qiáng)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅可以通過(guò)合成與分泌抗體介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，還能分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)［1］。B淋巴細(xì)胞在抗SIV/HIV感染中也有一定的免疫保護(hù)作用，但因機(jī)體內(nèi)影響因素眾多，導(dǎo)致在研究其具體功能時(shí)受到了一定的干擾，所以應(yīng)用B細(xì)胞敲除的方法反向研究B淋巴細(xì)胞在SIV/HIV感染中的作用，具有非常重要的意義。鑒于目前缺乏去除恒河猴體內(nèi)B淋巴細(xì)胞的試劑，本研究擬通過(guò)一次性靜脈滴注抗人B淋巴細(xì)胞單克隆抗體去除恒河猴 B淋巴細(xì)胞，評(píng)估并測(cè)定中國(guó)恒河猴外周血、外周淋巴結(jié)及十二指腸腸黏膜組織中B淋巴細(xì)胞敲除效果及轉(zhuǎn)歸情況，為深入探討B(tài)淋巴細(xì)胞SIV/HIV感染中的作用，與病毒的復(fù)制以及疾病進(jìn)程的關(guān)系，提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康中國(guó)恒河猴2只，購(gòu)自北京協(xié)爾鑫公司［SCXK(京)2005-2005］，體重3.2kg～3.5kg。間接免疫熒光法(IFA)檢測(cè)排除相關(guān)慢病毒——猴免疫缺陷病毒(SIV)、猴逆轉(zhuǎn)錄D型病毒(SRV-1)、猴T淋巴細(xì)胞性I型病毒(STLV-1)的感染。

1.2 試劑

1.2.1 利妥昔單抗注射液(rituximab，50mg/kg)：商品名美羅華(MabThera，Cat No.B6094)，是Roche公司生產(chǎn)的抗人B淋巴細(xì)胞單克隆抗體。

1.2.2 流式抗體：Percp anti-human CD3(BD，Cat No.552851)，F(xiàn)ITC anti-human CD4(Biolegend，Cat No.317408)，PE anti-human CD8(Biolegend，Cat No.301008)，APC anti-human CD20(Biolegend，Cat No.302310)。

1.3 給藥方式

中國(guó)恒河猴2只，G1205和 G1206，按50mg/kg劑量下肢靜脈滴注利妥昔單抗注射液。靜脈滴注過(guò)程中注意速度(約60滴/min，全部過(guò)程(1～2) h完成)，同時(shí)注意預(yù)防過(guò)敏等不良反應(yīng)的發(fā)生。

1.4 組織細(xì)胞取材和預(yù)處理

1.4.1 外周血的采集：靜脈滴注前及靜脈滴注后1、4、7、10、14、18、21、25、28、42、56d采集實(shí)驗(yàn)猴EDTA抗凝血進(jìn)行流式檢測(cè)。

1.4.2 外周淋巴結(jié)采集及細(xì)胞分離：靜注前及靜注后7、14、21、28、42、56d采集腹股溝淋巴結(jié)。在生物安全柜中將淋巴結(jié)的包膜以及脂肪組織剔除，沖洗干凈、剪碎，置于70μm的尼龍細(xì)胞篩上輕輕研磨，用含5%胎牛血清及5%雙抗(10000單位/mL青霉素和10000μg/m L鏈霉素)的RPM I 1640培養(yǎng)基沖洗。離心并收集細(xì)胞沉淀，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個(gè)/m L。

1.4.3 腸道組織采集及細(xì)胞分離：動(dòng)物在行內(nèi)窺鏡前禁食8h～12h，給予復(fù)方氯胺酮注射液(生理鹽水1：5稀釋后0.1m L/kg)肌內(nèi)注射麻醉，然后使用Olympus內(nèi)窺鏡(型號(hào)GIF-160)及配套設(shè)備，在十二指腸降段取4～6塊活檢組織［2］。將新鮮腸道組織置于70μm的尼龍細(xì)胞篩上輕輕研磨，并用含5%胎牛血清以及5%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基沖洗。離心并收集細(xì)胞沉淀，調(diào)整濃度至1×106個(gè)/m L。

1.5 流式抗體檢測(cè)

將EDTA抗凝血和新鮮制備的淋巴細(xì)胞進(jìn)行流式抗體檢測(cè)。分別取50μL的EDTA抗凝血或淋巴細(xì)胞懸液(106個(gè)/50μL)，依次加入流式抗體—CD3(percp)、CD8(PE)、CD4(FITC)和CD20(APC)。室溫避光作用15min后(全血檢測(cè)管需另加入終濃度10%的紅細(xì)胞裂解液，4℃作用10min)，重懸于pH 7.2PBS中，F(xiàn)ACS儀上分類計(jì)數(shù)［3］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Flowjo version 7.6進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析，作圖及統(tǒng)計(jì)分析由Graphpad Prism 5完成。

2 結(jié)果

2.1 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后外周血中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化

靜脈滴注利妥昔單抗注射液作用24h后，恒河猴G1205和G1206外周血中B淋巴細(xì)胞的百分比即從正常的50%左右降低到0%，絕對(duì)數(shù)也從第0天的240cells/μL降到了0，去除率達(dá)到100%，去除時(shí)間維持約14d。28d時(shí) B淋巴細(xì)胞的百分比

恢復(fù)到4～8%左右，絕對(duì)數(shù)也逐漸恢復(fù)到10～30cells/μL。到56d時(shí)，已接近實(shí)驗(yàn)前的水平(圖1A，B)。在 B淋巴細(xì)胞成功去除的同時(shí)，CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞波動(dòng)平穩(wěn)，CD4+T淋巴細(xì)胞的波動(dòng)范圍在60～70%之間，CD8+T淋巴細(xì)胞的波動(dòng)范圍在20～40%之間(圖1C，D)。

2.2 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化

實(shí)驗(yàn)前，G1205和G1206兩只恒河猴腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞比例為20%～30%，利妥昔單抗注射液靜脈滴注后7 d，B淋巴細(xì)胞比例為0%，去除率達(dá)到100%，到第21天之前，B淋巴細(xì)胞升高幅度很小，恢復(fù)到3%左右。到第28天時(shí)，B淋巴細(xì)胞比例較前明顯上升，56d時(shí)，G1206號(hào)猴B淋巴細(xì)胞恢復(fù)接近正常值，G1205號(hào)猴恢復(fù)到15%左右(圖2A)。

圖1 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后外周血中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化注：A：CD20+細(xì)胞的百分比；B：CD20+細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)；C：CD4+T細(xì)胞的百分比；D：CD8+T細(xì)胞的百分比Fig.1 Changes of the concentrations of B-and T-cell subsets in peripheral blood afterintravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The absolute numbers of CD20+cells；C：The percentage of CD4+T-cells；D：The percentage of CD8+T-cells

圖2 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后腹股溝淋巴結(jié)中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化注：A：CD20+細(xì)胞的百分比；B：CD4+T細(xì)胞的百分比；C：CD8+T細(xì)胞的百分比；LN：淋巴結(jié)Fig.2 Percentage of B-and T-cell subsets in the inguinal lymph nodes after intravenous injection of RituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T-cells；C：The percentage of CD8+T-cells.LN：inguinal lymph nodes

在靜注利妥昔單抗注射液之前G1205和G1206兩只恒河猴的腹股溝淋巴結(jié)中的CD4+T淋巴細(xì)胞

約75%左右，靜脈滴注后第14天時(shí)稍有下降，約降低到60%左右，隨后的兩個(gè)月內(nèi)都較平穩(wěn)，并一直維持在60%～70%之間；其CD8+T淋巴細(xì)胞在靜脈滴注利妥昔單抗注射液之后的第14天時(shí)由第0天的15～20%上升到了30%左右，之后的兩個(gè)月內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞的水平維持在 25% ～35%之間(圖2B，C)。

2.3 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后十二指腸黏膜固有層中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化

兩只實(shí)驗(yàn)猴在實(shí)驗(yàn)前十二指腸黏膜固有層中B淋巴細(xì)胞比例約為5%～10%。靜脈滴注利妥昔單抗注射液后7 d，降低到1.0% ～1.5%，去除率約80% ～90%。恒河猴 G1205一直維持這種狀態(tài)至觀察結(jié)束的56d，G1206維持到28d，隨后升高，42d時(shí)達(dá)到30%，56d時(shí)下降到20%(圖3A)。

十二指腸黏膜固有層中的CD4+T細(xì)胞只在第14天時(shí)由第7天的15%上升到29% ～36%之間，其余時(shí)間點(diǎn)的CD4+T細(xì)胞的水平未見(jiàn)明顯波動(dòng)，均維持在10%～20%之間，其CD8+T細(xì)胞的水平與CD4+T細(xì)胞相反，在第14天時(shí)，兩只恒河猴的CD8+T細(xì)胞均有所下降，到第21天時(shí)，其 CD8+T細(xì)胞上升到60%～70%之間(圖3B，C)。

圖3 靜脈滴注利妥昔單抗注射液后十二指腸黏膜固有層中B淋巴細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的變化注：A：CD20+細(xì)胞的百分比；B：CD4+T細(xì)胞的百分比；C：CD8+T細(xì)胞的百分比；LP：指腸黏膜固有層Fig.3 Changes of the percentages of B-and T-cell subsets in the duodenal biopsy specimens after intravenous injection of rituximabNote：A：The percentage of CD20+cells；B：The percentage of CD4+T cells；C：The percentage of CD8+T cells；LP：Duodenal biopsy specimens

3 討論

B淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，不僅可以通過(guò)合成與分泌抗體介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，還能通過(guò)分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)［1］。以往研究表明，與正常HIV-1感染者相比，B淋巴細(xì)胞缺失患者的病毒載量要高2個(gè)數(shù)量級(jí) (1.7 log10)［5］。Miller等人也在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲除了B淋巴細(xì)胞的恒河猴與正常感染SIV的恒河猴相比較，不僅能使病毒載量升高，而且發(fā)展成為 AIDS的時(shí)間也會(huì)縮短［6］。這些都充分說(shuō)明，B淋巴細(xì)胞在控制SIV/HIV病毒感染中發(fā)揮著重要的作用。但因機(jī)體內(nèi)影響因素眾多，導(dǎo)致在研究其具體功能時(shí)受到了一定的干擾。國(guó)外近幾年已經(jīng)開(kāi)始利用利妥昔單抗開(kāi)展AIDS的研究工作，目的在于利用B淋巴細(xì)胞缺失的動(dòng)物模型，反向研究在B淋巴細(xì)胞缺失的情況下，SIV/HIV感染時(shí)機(jī)體免疫水平和病毒水平的變化，從而間接地了解B淋巴細(xì)胞的功能。目前這項(xiàng)工作在國(guó)內(nèi)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域還是空白。

本研究使用抗人B淋巴細(xì)胞單克隆抗體(利妥昔單抗注射液)，通過(guò)靜脈滴注的方式，觀察一次性給藥后中國(guó)恒河猴外周血及淋巴組織B淋巴細(xì)胞敲除情況。在長(zhǎng)達(dá)兩個(gè)月的觀察期內(nèi)，系統(tǒng)測(cè)定了外周血、外周淋巴結(jié)及腸黏膜固有層中B淋巴細(xì)胞的比例變化情況。結(jié)果表明，利妥昔單抗能夠降低甚至完全去除恒河猴血液、腹股溝淋巴結(jié)中的B淋巴細(xì)胞，其外周血和淋巴結(jié)中的B淋巴細(xì)胞的去除率達(dá)到100%。十二指腸腸粘膜固有層中B細(xì)胞的去除率也能達(dá)到80%以上，且能持續(xù)28d甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這個(gè)結(jié)果顯示B細(xì)胞在十二指腸黏膜中的清除時(shí)間比外周血和淋巴結(jié)中的清除時(shí)間都更持久。這一結(jié)果與 Gaufin等人的研究基本相同［7］。不同的是，近幾年國(guó)外在開(kāi)展此項(xiàng)研究時(shí)，基本上是采取連續(xù)給藥的方式。Gaufin在對(duì)非洲綠猴進(jìn)行B淋巴細(xì)胞敲除時(shí)，就采取每21d靜注 Rituximab一次的方案，直到SIVagm感染后的第184天［7］。本研究沒(méi)有使用上述方法，只是進(jìn)行了單次滴注，主要是為了了解中國(guó)恒河猴在靜脈滴注妥昔單抗注射液后各個(gè)組織中B淋巴細(xì)胞的去除效果及轉(zhuǎn)歸規(guī)律，得到第一手的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為今后深入開(kāi)展B淋巴細(xì)胞功能研究提供依據(jù)，以便根據(jù)具體的研究目的制訂相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)方案。

在靜脈注射利妥昔單抗注射液之前，我們分別檢測(cè)了血液，腹股溝淋巴結(jié)以及十二指腸黏膜組織中的B細(xì)胞和T細(xì)胞亞群的變化，各組織中CD20+B淋巴細(xì)胞的百分比均與之前文獻(xiàn)報(bào)道的一致［7］。血液和淋巴結(jié)中，CD4+T淋巴細(xì)胞在60%～80%之間，CD8+T淋巴細(xì)胞在20～40%之間；而在十二指腸黏膜固有層中 CD4+T淋巴細(xì)胞的比例卻只有15% ～40%，CD8+T淋巴細(xì)胞比例的波動(dòng)范圍較大，在35% ～70%之間。腸黏膜固有層中 CD4+T淋巴細(xì)胞的比例與血液和淋巴結(jié)相比較含量最低，這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期研究的結(jié)果相符合［3］。但總的來(lái)說(shuō)，在成功去除B淋巴細(xì)胞的情況下，T淋巴細(xì)胞變化較平穩(wěn)，保持了體內(nèi)的基本穩(wěn)定狀態(tài)，在比例上沒(méi)有過(guò)多受B淋巴細(xì)胞去除的影響。也有研究表明，在小鼠體內(nèi)敲除B淋巴細(xì)胞后，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒感染后并未出現(xiàn)表型和功能異常的T細(xì)胞，這就保證了在B淋巴細(xì)胞去除的情況下，CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞能維持相對(duì)穩(wěn)定的功能。這一結(jié)果對(duì)我們研究B淋巴細(xì)胞的功能方面是有益處的。

總之，無(wú)論是血液，淋巴結(jié)還是十二指腸黏膜固有層，抗人B淋巴細(xì)胞單克隆抗體(利妥昔單抗注射液)均能有效去除恒河猴體內(nèi)B淋巴細(xì)胞，并且在成功敲除 B淋巴細(xì)胞的情況下，CD4+T及CD8+T淋巴細(xì)胞無(wú)明顯波動(dòng)，維持在一個(gè)穩(wěn)定的水平。

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