朱振華，呂農(nóng)華，黃德強(qiáng)，謝 勇，王崇文，劉林林

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院，南昌330006)

幽門螺桿菌(Hp)在人群中感染率很高，在慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤等消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用［1～3］;此外，該菌還與某些肝膽、心腦血管及皮膚病等有關(guān)。消化學(xué)界認(rèn)為根除Hp是防治這些疾病的重要措施。我國(guó)屬于發(fā)展中國(guó)家，在全球范圍內(nèi)屬于感染率較高的地區(qū)，因此Hp根除治療顯得尤為重要。阿莫西林是根除Hp感染治療中重要的抗生素，其耐藥是Hp根除失敗的主要原因之一。我們于2006年5月～2007年1月進(jìn)行本研究，探討Hp根除治療失敗后阿莫西林的耐藥機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株 Hp菌株來自于南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化科內(nèi)鏡室，其中阿莫西林敏感菌株5株，原始耐藥菌株6株，根除治療失敗后的耐藥菌株4株。

1.2 藥敏實(shí)驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)，根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)中抑菌圈的大小來判定臨床菌株是否耐藥。結(jié)果判斷:用卡尺量取抑菌圈直徑。Hp耐藥標(biāo)準(zhǔn)［4］:抑菌圈直徑＜30 mm。質(zhì)量控制:藥敏實(shí)驗(yàn)加入標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株Hp11637，作為敏感對(duì)照菌株。

1.3 耐藥基因的PCR擴(kuò)增 采用北京天為時(shí)代科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)制備Hp基因組DNA。PCR擴(kuò)增采用高保真PCR擴(kuò)增試劑盒擴(kuò)增Hp PBP1A的1 048 bp片段，PCR擴(kuò)增分兩輪進(jìn)行:第一輪PCR反應(yīng)體系由5 μL 2×pfu PCR mastermix、2.5 μL ddH2O、1 μL上游引物、1 μL下游引物及0.5 μL DNA模板組成，總體積為10 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃4 min預(yù)變性;94℃1 min變性，61.5℃40 s退火，72℃1.5 min延伸，共30個(gè)循環(huán);72℃7 min延伸。PCR反應(yīng)產(chǎn)物于－20℃保存?zhèn)溆?。第二輪PCR反應(yīng)體系由20 μL 2×pfu PCR mastermix、10 μL ddH2O、4 μL上游引物、4 μL下游引物及2 μL DNA模板組成，總體積為40 μL。上游引物:5'-GCGTCTAATGAAGATGAAGA-3'，下游引物:5'-TTAAAGTCCCTATAGCCATG-3'。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件:94℃4 min預(yù)變性;94℃ 1 min變性，61.5℃ 40 s退火，72℃1.5 min延伸，共35個(gè)循環(huán);72℃7 min延伸。PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳觀察。采用北京天為時(shí)代科技有限公司的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(離心柱型)回收純化PCR產(chǎn)物。

1.4 DNA測(cè)序及對(duì)比分析 將所有回收純化的PCR產(chǎn)物送上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。采用DNA Star軟件包對(duì)測(cè)序結(jié)果閱讀、整理，對(duì)比分析原始耐藥、敏感菌株、根除失敗后耐藥菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株的耐藥基因差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析，描述同源性符合率采用±s，比較各組間同源性的差異時(shí)采用方差分析或t檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn) 345例菌株中，阿莫西林原始敏感菌株322例，原始耐藥菌株23例，原始耐藥率達(dá)6.7%。另20例根除治療失敗的Hp菌株中，阿莫西林耐藥菌株5例，敏感菌株15例。

2.2 耐藥基因PBP1A的PCR產(chǎn)物 原始耐藥菌株6株，敏感菌株5株，根除失敗后耐藥菌株4株，其PCR產(chǎn)物均出現(xiàn)1 048 bp(26695 Hp0597 PBP1A的一部分)的條帶，未見異常條帶。圖1為根除失敗的4株耐藥菌株電泳圖。

圖1 PBP1A基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 23S rRNA的突變分析

2.3.1 臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp26695同源性比較

成功完成DNA測(cè)序者原始阿莫西林耐藥菌株6株、敏感菌株5株和根除失敗后耐藥菌株4株。采用DNA Star軟件包中MegAlign軟件將臨床菌株的PBP1A序列與Hp26695的PBP1A序列進(jìn)行同源性比較，同源性分別為90.26%±3.45%、95.52%± 2.73%、95.48%±0.89%，P＞0.05，臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株的同源性結(jié)果基本相似。

2.3.2 臨床菌株的框移突變情況 對(duì)臨床菌株的PBP1A基因框移突變進(jìn)行比較，采用DNA Star軟件包中 MegAlign軟件將臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp26695 PBP1A對(duì)比進(jìn)行DNA分析，結(jié)果表明:臨床耐藥菌株的框移突變比敏感菌株發(fā)生率高，阿莫西林敏感菌株框移突變0例，原始耐藥菌株2例，根除失敗后耐藥菌株1例。其中2株原始耐藥菌株與1株根除失敗的耐藥菌株發(fā)生框移突變導(dǎo)致突變以后的蛋白質(zhì)氨基酸的翻譯發(fā)生嚴(yán)重改變，其他耐藥菌株突變主要為堿基的替代，只引起單個(gè)氨基酸改變，不導(dǎo)致整條肽鏈的改變;而在敏感菌株未見任何框移突變。由于例數(shù)過少，故未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3.3 臨床菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株氨基酸序列同源性比較 采用DNA Star軟件包中的MegAlign軟件，將臨床菌株與Hp26695氨基酸序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果表明:原始耐藥菌株和根除失敗后耐藥菌株的PBP1A氨基酸序列同源性比敏感菌株低。方差分析示，原始敏感菌株(93.28%±6.21%)與原始耐藥菌株(40.52%±18.48%)及根除失敗后耐藥菌株(80.05%±32.01%)兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。

3 討論

β-內(nèi)酰胺類抗生素在體外有很高的抗Hp活性，阿莫西林是臨床上惟一用于治療Hp感染的β-內(nèi)酰胺類抗生素，它在酸性環(huán)境下高度穩(wěn)定，可專一地與細(xì)菌內(nèi)膜上靶位點(diǎn)結(jié)合干擾細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合成，使細(xì)菌胞壁缺損，菌體膨脹裂解而致細(xì)菌死亡。那些能與青霉素G共價(jià)結(jié)合的細(xì)菌內(nèi)膜靶位點(diǎn)被稱之為青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)，它是一系列合成細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層的酶。最初研究［5］顯示，有3種高分子量 PBPs存在，被命名為 PBP1、PBP2和PBP3。后來又發(fā)現(xiàn)一種低分子量PBPs，被命名為PBP4［6］。PBP1A基因作為PBP1蛋白的編碼基因之一，與 Hp阿莫西林耐藥性密切相關(guān)。Gerrits等［7］用阿莫西林耐藥菌株的PBP1A基因替代敏感菌株1061的PBP1A基因，使敏感菌株1061的最低抑菌濃度增加了100倍，序列分析發(fā)現(xiàn)PBP1蛋白中存在絲氨酸414→精氨酸置換，因此他們認(rèn)為在PBP1蛋白中的氨基酸置換會(huì)導(dǎo)致阿莫西林最低抑菌濃度的升高。有文獻(xiàn)報(bào)道，阿莫西林耐藥還與β-內(nèi)酰胺酶有關(guān)，但Dore等［8］研究發(fā)現(xiàn)所有對(duì)阿莫西林耐藥的菌株β-內(nèi)酰胺酶均陰性;且大量臨床研究也證實(shí)β-內(nèi)酰胺酶抑制劑并不能使含阿莫西林的根除方案根除率提高。由此可以看出β-內(nèi)酰胺酶仍難以解釋阿莫西林耐藥，而PBP1A基因突變才可能是阿莫西林耐藥性產(chǎn)生的主要原因。

本課題通過對(duì)原始敏感菌株、耐藥菌株和根除失敗后耐藥菌株的研究，發(fā)現(xiàn)原始耐藥菌株及根除失敗后耐藥菌株P(guān)BP1A基因核苷酸的同源性與敏感菌株統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異;根除失敗后耐藥菌株突變頻率稍低于原始耐藥菌株，這可能與原始耐藥菌株受長(zhǎng)期外界刺激、抽樣誤差及樣本含量過少有關(guān)。通過氨基酸序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，原始耐藥菌株和根除失敗后的耐藥菌株P(guān)BP1氨基酸序列同源性均低于敏感菌株，提示氨基酸的置換可能會(huì)導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。尤其是其中3株耐藥菌株因堿基的缺失或插入導(dǎo)致框移突變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出的蛋白質(zhì)完全不同而最終導(dǎo)致阿莫西林無法與Hp結(jié)合，耐藥性便隨之產(chǎn)生。而在我們所研究的敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)一株出現(xiàn)框移突變。因此，我們認(rèn)為PBP1蛋白的氨基酸置換可能與阿莫西林耐藥有密切關(guān)系。理論上講，有框移突變的臨床菌株耐藥程度應(yīng)該顯著高于其他形式突變所致的耐藥菌株，但由于我們的藥敏實(shí)驗(yàn)方法適用于確定耐藥性，在確定耐藥程度上還有一定缺陷，而E-test法相對(duì)比較準(zhǔn)確。下一步可考慮對(duì)這幾株出現(xiàn)框移突變的菌株進(jìn)行E-test藥敏法確定其耐藥程度，以明確框移突變?cè)谝鹉退幮约澳退幊潭确矫嫠鸬淖饔谩ｋm然E-test藥敏法較為精確且方便，但其昂貴的價(jià)格并不適于我們進(jìn)行大規(guī)模的藥敏實(shí)驗(yàn)，因此我們藥敏實(shí)驗(yàn)在初篩時(shí)還是首選紙片擴(kuò)散法。

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