富莉娜，顏亨梅，段妍慧

（湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院動(dòng)物生態(tài)研究室，湖南 長(zhǎng)沙 410081）

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球約三分之一以上的人口以水稻為主食，僅中國(guó)就有8億人[1-2]。近年來(lái)，雜草每年造成的經(jīng)濟(jì)損失占農(nóng)作物總產(chǎn)量的10%～20%，為減少損失，人們廣泛研制和使用多種除草劑[3]。但在現(xiàn)有的水稻種質(zhì)資源中，對(duì)除草劑有天然抗性的野生水稻幾乎不存在，常規(guī)育種受到了很大限制。利用基因工程技術(shù)，將抗除草劑基因?qū)胨?，培育抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻新品種，為防除雜草提供了新途徑[4-5]。

同時(shí)，自轉(zhuǎn)基因作物問(wèn)世以來(lái)，其安全性就一直飽受爭(zhēng)議，尤其是作為主糧的轉(zhuǎn)基因水稻。而妊娠是雌性哺乳動(dòng)物所經(jīng)歷的一個(gè)特殊生理時(shí)期[6]。在妊娠期間，由于胚胎、胎兒生長(zhǎng)的需要，在胎盤產(chǎn)生的激素參與下，在神經(jīng)內(nèi)分泌的影響下，孕婦體內(nèi)各系統(tǒng)發(fā)生一系列適應(yīng)性的解剖和生理變化[7]，與非妊娠期間有著明顯的差別。試驗(yàn)在小白鼠飼喂轉(zhuǎn)Bar基因稻谷后測(cè)定其在妊娠期間血液生理指標(biāo)的變化，研究轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)妊娠情況的影響，旨在評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)妊娠期哺乳動(dòng)物安全性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組

動(dòng)物模型為18～24 g區(qū)間的SPF級(jí)昆明系小白鼠（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供）。將試驗(yàn)小白鼠隨機(jī)分為非轉(zhuǎn)基因組與轉(zhuǎn)基因組，再按照飼料中稻谷所占比重的不同分為20%、40%、60%3組。在飼室環(huán)境下，自由取食和飲水。飼養(yǎng)90 d后按照雌雄2∶1的比例進(jìn)行配種，當(dāng)晚將雄鼠放進(jìn)雌鼠籠內(nèi)。次日早晨檢查雌鼠，有陰道栓的判定為已受孕，并確定為懷孕第1天。在雌鼠妊娠第15天隨機(jī)抽取部分雌鼠解剖實(shí)驗(yàn)，剩余部分用于繁殖F1代。

1.2 飼料配制

試驗(yàn)組所選轉(zhuǎn)基因抗除草劑水稻品系Bar68-1（中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所將Bar基因轉(zhuǎn)入秈稻品種D68而培育的抗草丁膦早秈稻），非轉(zhuǎn)基因組所選為D68水稻品系。

試驗(yàn)在保證小鼠正常生命活動(dòng)不受影響（主要考慮蛋白的攝入量）的情況下，以AIN-93G為標(biāo)準(zhǔn)參照物，配比小鼠食物的成分（主要成分為飼料、魚粉、轉(zhuǎn)基因/非轉(zhuǎn)基因稻谷）。喂食添加轉(zhuǎn)Bar基因稻谷的飼料或相同品系的非轉(zhuǎn)基因稻谷。按照GBl5193.1-2003《食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序》[8]規(guī)定，設(shè)置低、中、高3個(gè)劑量組，稻谷的加入量分別為20%、40%、60%，最高劑量組是不影響膳食平衡的最大添加量。試驗(yàn)組在標(biāo)準(zhǔn)小鼠飼料中分別添加了20%、40%、60%轉(zhuǎn)Bar基因稻谷，用添加同品系非轉(zhuǎn)基因稻谷飼料作為對(duì)照組。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 妊娠小鼠體重變化 對(duì)妊娠小鼠體重的增加進(jìn)行觀察，各組分別于妊娠的 0、5、10、15、20 d稱重，觀察體重的變化。

1.3.2 血液生化檢測(cè) 試驗(yàn)前小鼠禁食12 h，自由飲水。在妊娠第15天每組隨機(jī)抽取5只妊娠小鼠進(jìn)行眼球摘除靜脈采血，稀釋液迅速搖勻抗凝后立即用全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定。

1.3.3 觀察生殖力 每只妊娠小鼠觀察有無(wú)陰道出血、流產(chǎn)等情況，并分組做詳細(xì)記錄。于妊娠第14～15日處死小鼠，解剖后取出雙側(cè)子宮置于干凈彎盤內(nèi)立即數(shù)雙側(cè)子宮著床點(diǎn)數(shù)以及活胎數(shù)，計(jì)數(shù)流產(chǎn)數(shù)、胎仔數(shù)，記錄具體數(shù)據(jù)。

流產(chǎn)數(shù)=著床點(diǎn)數(shù)－活胎數(shù)

妊娠率=妊娠動(dòng)物數(shù)/實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)×100%

流產(chǎn)率=流產(chǎn)數(shù)/著床點(diǎn)數(shù)×100%

1.3.4 統(tǒng)計(jì)處理 所有數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件中One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)各代妊娠小鼠體重的影響

兩代妊娠小鼠體重增長(zhǎng)均呈規(guī)律性變化。在妊娠初期（0～5 d，5～10 d）這兩個(gè)階段，小鼠體重增長(zhǎng)緩慢，平均每個(gè)階段增長(zhǎng)5 g，在妊娠中后期（10～15 d，15～20 d）這兩個(gè)階段，小鼠體重增長(zhǎng)加快，平均每個(gè)階段增長(zhǎng)10 g。

2.2 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)各代妊娠小鼠血液生理指標(biāo)的影響

2.2.1 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)親代妊娠小鼠血液生理指標(biāo)的影響 由表1的結(jié)果可知，40%稻谷含量的對(duì)比中，轉(zhuǎn)基因組紅細(xì)胞總數(shù)（RBC），紅細(xì)胞壓積（HCT）和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量（MCH）均顯著高于非轉(zhuǎn)基因組，具有差異顯著（P<0.05），各指標(biāo)值均在正常參考值范圍內(nèi)；其他各組差異不顯著（P>0.05）。

表1 轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對(duì)親代妊娠小鼠血液生理指標(biāo)的影響

2.2.2 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)F1代妊娠小鼠血液生理指標(biāo)的影響 由表2的結(jié)果可知，20%稻谷含量的對(duì)比中，轉(zhuǎn)基因組的白細(xì)胞總數(shù)（WBC）、平均紅細(xì)胞體積（MCV）和血小板含量（PLT）均顯著低于非轉(zhuǎn)基因組，具有差異性顯著（P<0.05），且20%非轉(zhuǎn)基因組中白細(xì)胞總數(shù)與血小板含量均高于正常參考值范圍；其他各組差異不顯著（P>0.05）。

表2 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)F1代妊娠小鼠血液生理指標(biāo)的影響

2.3 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)妊娠小鼠生殖力的影響

由表3、表4可知，轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)親代、F1代孕鼠的生殖力均無(wú)顯著（P＞0.05）影響。

表3 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)親代妊娠小鼠生殖力的影響

表4 轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)F1代妊娠小鼠生殖力的影響

3 討 論

目前，轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)，已在許多實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究。由于試驗(yàn)設(shè)計(jì)依據(jù)不同，所以轉(zhuǎn)基因作物的種類也有很大的差別，抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻、抗病轉(zhuǎn)基因水稻及抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻均有研究，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的結(jié)論較為一致，即總體上未發(fā)現(xiàn)對(duì)機(jī)體有損傷作用。如王忠華等[9]對(duì)轉(zhuǎn)Bt水稻進(jìn)行了急性毒理學(xué)評(píng)價(jià)，大鼠90 d喂養(yǎng)試驗(yàn)，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt基因水稻組和對(duì)照組之間在大鼠增重、攝食量等方面有差異。Momma等[10]將轉(zhuǎn)入了大豆球蛋白的高蛋白大米加水磨成粉（25%，W/V）后，按照10 g/kg體重的劑量灌胃SD大鼠，以非轉(zhuǎn)基因親本大米作為對(duì)照。三周后，兩組大鼠的體重、食物利用率，血液學(xué)指標(biāo)和臟器重等營(yíng)養(yǎng)學(xué)指標(biāo)無(wú)明顯差異。王茵等[11]用抗除草劑轉(zhuǎn)Bar基因水稻按照3個(gè)劑量組飼喂大鼠30 d，結(jié)果表明各劑量組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育、體重、食物利用率、血常規(guī)、臟體比及病理組織學(xué)觀察等指標(biāo)與陰性對(duì)照組差異不顯著。筆者以前的研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)Bar基因水稻對(duì)親代、F1代妊娠小鼠沒有亞慢性毒性損害及多代毒性累積的影響[12]。

3.1 小鼠妊娠情況

連續(xù)90 d喂養(yǎng)，妊娠期間小鼠未見陰道出血，流產(chǎn)等情況出現(xiàn)。妊娠15 d解剖觀察結(jié)果，胎鼠外觀未見畸形，發(fā)育良好。著床數(shù)、活胎數(shù)和流產(chǎn)數(shù)與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異（P>0.05），各轉(zhuǎn)基因組之間相比也無(wú)顯著性差異（P>0.05）。李英華等[13-14]和卓勤等[15]分別對(duì)轉(zhuǎn)Xa21和轉(zhuǎn)CpTI水稻進(jìn)行了老鼠傳代致畸性研究。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大米組與非轉(zhuǎn)基因大米組相比，大鼠受孕率、胚胎生長(zhǎng)情況均無(wú)顯著性差異。由此可見，轉(zhuǎn)Bar基因稻谷不會(huì)對(duì)妊娠小鼠的妊娠情況及胚胎發(fā)育造成不良著影響。

3.2 小鼠血液生理指標(biāo)

血液生理指標(biāo)的檢查是通過(guò)觀察血液細(xì)胞數(shù)量的變化及形態(tài)分布來(lái)判斷疾病，反映骨髓的造血功能，可以及早的發(fā)現(xiàn)和診斷疾病。血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板這3類細(xì)胞，分別有著各自不同的功能。白細(xì)胞依靠其具有的游走、趨化性和吞噬作用等特性，實(shí)現(xiàn)其對(duì)機(jī)體的免疫保護(hù)等功能。紅細(xì)胞主要的生理功能是作為呼吸載體，保證組織呼吸需要，加強(qiáng)機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。紅細(xì)胞數(shù)的顯著增加對(duì)改善妊娠小白鼠子宮胎盤血液循環(huán)、改善細(xì)胞缺血缺氧所致的代謝障礙和促進(jìn)胎兒生長(zhǎng)有重要作用。血小板的功能主要是促進(jìn)止血和加速凝血。

試驗(yàn)對(duì)妊娠期小鼠8項(xiàng)血液學(xué)指標(biāo)檢查表明，親代孕鼠40%轉(zhuǎn)基因組的紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積和平均紅細(xì)胞血紅蛋白含量與40%常規(guī)對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05），但在正常值范圍內(nèi)[16]。F1代孕鼠20%常規(guī)對(duì)照組的白細(xì)胞、平均紅細(xì)胞體積和血小板顯著高于20%轉(zhuǎn)基因組，提示20%常規(guī)對(duì)照組孕鼠有可能發(fā)生感染（白細(xì)胞數(shù)和血小板同時(shí)顯著升高時(shí)多見于急性感染）。從親代和F1代血液學(xué)指標(biāo)的結(jié)果可以得出，轉(zhuǎn)Bar基因水稻對(duì)妊娠期小鼠的血液學(xué)指標(biāo)沒有影響，結(jié)論與王茵等[17]、薛大偉等[18]的研究結(jié)果相似。

綜上所述，在該試驗(yàn)條件下，飼喂轉(zhuǎn)Bar基因稻谷對(duì)妊娠小鼠的生殖及健康沒有亞慢性毒性損害及多代的毒性累積的影響。

[1]楊友才，周清明.轉(zhuǎn)基因水稻研究進(jìn)展[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2003，29（1）：85-88.

[2]朱 禎.高效抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻的研究與開發(fā)[J].中科學(xué)院院刊，2001，（5）：353-357.

[3]樓士林，楊盛昌，龍敏南.基因工程[M].北京:科學(xué)出版社，2002.

[4]孟穎穎，李克斌，吳忠義，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻及其生物安全性的探討[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，2006，22（10）：70-74.

[5]玄立杰，謝英添.轉(zhuǎn)基因食品安全問(wèn)題及其評(píng)價(jià)體系[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（25）：14175-14177.

[6]姜國(guó)湖，陳 芋，張 華，等.佛手散對(duì)妊娠大鼠TNF-α的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2010，（2）161-162.

[7]樂(lè) 杰.婦產(chǎn)科學(xué)（7版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.34-36.

[8]吳發(fā)強(qiáng)，王世全，李雙成，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的研究進(jìn)展及其安全性問(wèn)題[J].分子植物育種，2006，4（6）：846-852.

[9]王忠華，王 茵，崔海瑞，等.Bt水稻“克螟稻”稻米毒理性評(píng)價(jià)研究初報(bào)[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（12）：1487-1492.

[10]Momma K,Hashimoto W,Yoon H,et al.Safety assessment of rice genetically modified with soybean glycinin by feeding studies on rats[J].BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,2000,64(9):1881-1886.

[11]王 茵，萊偉旗，陳建國(guó)，等.抗除草劑基因（BAR）轉(zhuǎn)基因水稻的毒性試驗(yàn)[J].衛(wèi)生研究，2000，29（3）：141-142.

[12]富莉娜，顏亨梅，段妍慧，等.轉(zhuǎn)Bar基因抗除草劑稻谷對(duì)妊娠小鼠亞慢性毒性的響應(yīng)[J]安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（11）：6570-6572.

[13]李英華，樸建華，陳小萍，等.Xa21轉(zhuǎn)基因大米的營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)[J].衛(wèi)生研究，2004，33（3）：303-306.

[14]李英華.Xa21轉(zhuǎn)基因大米的食用安全性研究[D].北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所，2005.

[15]卓 勤，陳小萍，樸建華，等.轉(zhuǎn)豇豆胰蛋白酶抑制劑大米的致畸作用研究[J].衛(wèi)生研究，2004，33（1）：74-77.

[16]鄭圈輝，周淑佩，彭雙清.實(shí)用醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2008.

[17]王 茵，來(lái)偉旗，陳建國(guó)，等.轉(zhuǎn)基因稻米的安全性試驗(yàn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2000，10（2）：157-159.

[18]薛大偉，馬麗蓮，姜 華，等.抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評(píng)價(jià)[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2005，13（6）：723-727.