劉佳勝，周日寶*，李鳳娟，王朝暉，劉湘丹，孫夢(mèng)姍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

人工栽培大葉千斤拔總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化研究

劉佳勝，周日寶*，李鳳娟，王朝暉，劉湘丹，孫夢(mèng)姍

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的 探討人工栽培大葉千斤拔藥材的最佳采收期。方法 采用紫外-分光光度法測(cè)定不同采收期根和莖中總黃酮含量的動(dòng)態(tài)變化，樣品用95%乙醇超聲提取3次，每次50 min，以蘆丁為對(duì)照品，測(cè)定波長為510 nm。結(jié)果人工栽培大葉千斤拔根中總黃酮含量高于莖中的含量，根中的含量較高，且含量比較穩(wěn)定，莖中含量隨著生育期延長逐步增加。結(jié)論 大葉千斤拔以植株落葉進(jìn)入休眠期為藥材最佳采收期。

大葉千斤拔；人工栽培；總黃酮；采收期；藥用部位；紫外-分光光度法

《中國藥典》2010年版一部收錄了中成藥婦科千金片，該藥具有清熱除濕，益氣化瘀的功效，是婦科保健和治療的常用中成藥[1]。千斤拔藥材是中成藥婦科千金片的主要原料，其傳統(tǒng)用藥部位為其根部[2]，千斤拔中的主要有效成分為黃酮類化合物[3]，具有止血、化瘀功效。長期以來，中成藥婦科千金片生產(chǎn)中一直收購野生千斤拔原料，導(dǎo)致野生千斤拔資源瀕臨枯竭，千斤拔藥材已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足婦科千金片生產(chǎn)的需求。湖南省炎陵已開展了大葉千斤拔的人工種植，人工種植剛剛起步，本文探討了人工栽培大葉千斤拔的根和莖中總黃酮含量動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，以期為人工栽培大葉千斤拔藥材最佳采收期的確定提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)樣品采自湖南省炎陵縣大葉千斤拔人工種植研究試驗(yàn)基地，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)潘清平教授鑒定藥材原植物系豆科千斤拔屬大葉千斤拔（Flemingia macrophylla(willd.)prain）。 從 2009年10月5日起至2010年1月5日止每隔10 d采集植株，曬干，分別取植株的根、莖作實(shí)驗(yàn)供試品。

1.2 試劑

乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉（均為分析純），蘆丁對(duì)照品（中國藥品生物制品鑒定所提供，批號(hào)：1001080-200707）。

1.3 儀器

752pc型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A(鞏義市予華儀器有限公司）；FW135型中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取過40目篩的藥材粉末3 g精密稱定，加95%乙醇 100 mL，70℃超聲提取三次，每次50 min，濾過，合并濾液，減壓回收乙醇至濾液低于50 mL時(shí)，置50 mL量瓶中，加乙醇定容，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取于120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加入乙醇10 mL，置溫水中加熱使溶解，放冷，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液(含無水蘆丁 200μg／mL)。

2.3 吸收波長的確定

取對(duì)照品溶液和供試品溶液各5 mL，分別置25 mL量瓶中，定容，搖勻后分別于400～700 nm波長范圍掃描，兩種溶液在510 nm處均無吸收峰。另取對(duì)照品和供試品溶液各5 mL，分別置25 mL量瓶中，加 5%亞硝酸鈉 1 mL，搖勻，放置 6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置 6 min，加4%氫氧化鈉4 mL，再加乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后分別于400～700 nm波長范圍掃描，在510 nm處均有最大吸收。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置10 mL量瓶中，各加乙醇至10 mL，顯色方法同“2.3”，以相應(yīng)的溶液為空白對(duì)照。測(cè)定吸光度，繪制濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程

A=11.986 9C-0.035 7(r=0.996 8)

結(jié)果表明蘆丁在0.100～0.700 mg/mL范圍內(nèi)溶液濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，連續(xù)6次進(jìn)樣，測(cè)定吸光度，其吸光度的平均值為x=0.659，RSD=1.44%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于 0、1、3、6、9、12 h 進(jìn)行測(cè)定吸光度，其吸光度的平均值為x=0.657，RSD=2.08%，表明該溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次藥材6份，按“2.1”方法制備供試品溶液，測(cè)得其總黃酮含量的平均值x=0.551%，RSD=1.41%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取2009年10月05日的大葉千斤拔莖的藥材粉末1.50 g(總黃酮含量為0.553%)，精密加入蘆丁對(duì)照品，按“2.1”方法平行制備6份，精密量取供試品溶液3 mL，分別置50 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉4 mL，再加乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后測(cè)定。結(jié)果蘆丁的平均回收率為99.60%，RSD=2.12%。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n=6）

2.9 樣品含量測(cè)定

每次取3份相同采收期的大葉千斤拔藥材粉末各3 g，按照“2.1”項(xiàng)的方法處理后，精密量取供試品溶液3 mL，分別置50 mL量瓶中，加5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加4%氫氧化鈉4 mL，再加乙醇至刻度，搖勻，放置15 min后測(cè)定吸光度。用回歸方程計(jì)算總黃酮含量，測(cè)得同一采收期大葉千斤拔藥材的3個(gè)樣品的值，并計(jì)算其RSD值，結(jié)果見表2。

表2 大葉千斤拔不同采收期各部位總黃酮含量測(cè)定結(jié)果 （%，n=3）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品的提取考察了回流法、超聲法以及索氏提取法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲法提取總黃酮的含量高于索氏法，與回流法相當(dāng)，考慮到回流法提取時(shí)間長，消耗能量較多，因此選擇超聲提取法。

同一采收期，大葉千斤拔根中總黃酮含量高于莖中的。隨著植株生長期的延長，其莖中的總黃酮含量不斷增加，大葉千斤拔根中有效成分總黃酮含量最高，而根部的總黃酮含量變化不明顯，見圖1。

圖1 不同采收期大葉千斤拔根和莖中總黃酮含量的折線圖

大葉千斤拔中含有黃酮類、萜、甾類、鞣質(zhì)類、糖類、生物堿類和氨基酸類[4]等物質(zhì)，總黃酮是其主要的有效成分，可將其含量的高低作為衡量大葉千斤拔藥用價(jià)值的一個(gè)重要參考指標(biāo)。傳統(tǒng)上，民間習(xí)慣將大葉千斤拔的根入藥[2]，在大葉千斤拔整個(gè)生育期后期，根中有效成分總黃酮含量一直較高，在1.60%至1.83%之間，且含量比較穩(wěn)定，所以在植株生育后期采收藥材其藥用價(jià)值是比較高的，本文也從一個(gè)方面佐證了傳統(tǒng)上民間習(xí)慣用藥的科學(xué)性，即大葉千斤拔以植株落葉進(jìn)入休眠期采收較為合適。研究結(jié)果為大葉千斤拔野生變家種和人工規(guī)范化種植時(shí)適時(shí)采收提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

大葉千斤拔整個(gè)植株落葉進(jìn)入休眠期后，莖中有效成分總黃酮含量增高，達(dá)1.3%以上，其含量略低于根中的，同時(shí)二年生植株及其二年生以上的大葉千斤拔植株的莖的生物產(chǎn)量遠(yuǎn)大于根的，本文的研究結(jié)果也為大葉千斤拔的綜合開發(fā)和利用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：727.

[2]湖南省衛(wèi)生廳.湖南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[S].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1993：34.

[3]劉建華，高麗欣，高玉瓊，等.千斤拔揮發(fā)性成分的研究[J].中成藥，2003，25(6)：485-487.

[4]任朝琴，劉 圓.不同種不同藥用部位不同產(chǎn)地千斤拔中總黃酮的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(10)：2 492-2 494.

（本文編輯 楊 瑛）

Research on changes of total flavonoids content in cultivated Flemingia macrophylla(willd.)Prain

LIU Jia-sheng，ZHOU Ri-bao*，LI Feng-juan， WANG Zhao-hui，Liu Xiang-dan，SUN Meng-shan
（Pharmaceutical College,TCM University of Hunan，Changsha，Hunan 410208）

Objective To determine the optimum harvest time of the cultivated Flemingia macrophylla(Willd.)Prain.Method Using 95%ethanol ultrasound extraction for three times,once 50 minutes, rutin as reference substance, measured wavelength is 510 nm,the dynamic changes of total flavonoids in trunk and root with different harvest time is tested by UV spectrophotometry.Result Total flavonolds contents of cultivated Flemingia macrophylla(Willd.)Prain in root is more than trunk,total flavonoids content is always high and steady in root,and the content of total flavonoids in trunk is gradually increased as the extent of growth season.Conclusion The optimum harvest time of the Flemingia macrophylla(Willd.)Prain is in which the plant defoliation and enters dormancy stage.

Flemingia macrophylla(willd.)prain；Cultivated； Total flavonoids； Harvest times；Medical material part;ultraviolet spectrophotometer

R282.4

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.010.043.03

2012－03－07

湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺(tái)開放基金（09k061）；湖南省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（2009010）。

劉佳勝（1983-），湖南邵陽人，2009級(jí)碩士研究生，從事中藥資源與質(zhì)量研究。

* 周日寶，男，教授，博導(dǎo)，E-mail：zhouribao20032003@yahoo.com.cn。