吳大力 ，譚涵宇 ，彭清華

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科學重點學科，湖南 長沙 410007；2.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

蠐螬提取物對大鼠光損傷視網(wǎng)膜變性NF-κB表達及核轉(zhuǎn)位的影響

吳大力1，2，譚涵宇1*，彭清華1*

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院眼科學重點學科，湖南 長沙 410007；2.廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023）

目的 探討蠐螬提取物對大鼠光損傷視網(wǎng)膜變性核因子κB（NF-κB）表達的影響。方法 將48只大鼠隨機分成6組，分別為空白組、模型組、駐景丸組、蠐螬低、中、高劑量組，每組8只動物，16只眼。除空白組外，其余5組均建立光損傷視網(wǎng)膜變性模型，分組給藥3周后取材做NF-κB免疫組化檢測，計算機系統(tǒng)圖像分析結(jié)果并進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 與模型組比較，蠐螬中、高劑量組的NF-κB積分光密度和核轉(zhuǎn)位數(shù)增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結(jié)論蠐螬通過增加NF-κB信號通路的活化，抑制細胞凋亡死亡受體信號通路來發(fā)揮保護視網(wǎng)膜作用。

蠐螬提取物；光損傷；核因子κB；核轉(zhuǎn)位；大鼠

老年性黃斑變性（AMD），是臨床上老年人眼病中的常見病，是導致50歲以上老年人視力下降和致盲的主要原因之一。AMD病因很復雜，發(fā)病機制不明，近期國內(nèi)外的許多文獻報道其發(fā)病機制與長期光照的積累效應有關(guān)[1-2]。目前比較公認的是光損害及視網(wǎng)膜上皮細胞代謝功能衰退。由于視網(wǎng)膜光損傷的病理過程與AMD及視網(wǎng)膜色素變性有許多相似之處，因此，視網(wǎng)膜光損傷是研究視網(wǎng)膜變性類疾病良好的動物模型[3]。蠐螬是金龜子的幼蟲，《中藥大詞典》記載蠐螬有破血、行瘀、散結(jié)、通乳、解毒、消瘡、明目的功能[4]，本文通過建立視網(wǎng)膜光損傷大鼠模型，探討蠐螬提取物的干預作用，以及對大鼠光損傷視網(wǎng)膜變性核因子κB（NF-κB）表達及核轉(zhuǎn)位的影響?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 選用8周齡SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量150～170 g。動物由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心代購[許可證號 SCXK（湘）2008-0015]。

1.1.2 蠐螬提取物的制備 蠐螬1000 g，清洗10遍以上，浸泡12 h后，洗至無臭味。加蒸餾水5 kg，加37%HCl調(diào)pH 2。高壓蒸氣鍋蒸2 h(壓力0.15 MPa，壓力達 0.05 MPa 時放氣并計時)。 紗布（4～5層）過濾，溶液中加40%NaOH調(diào)pH 6.5～6.8。冷卻，隔水加熱，濃縮至1 000 mL（生藥1 g/mL）。裝瓶，壓蓋，蒸氣高溫滅菌，冷藏保存。

1.1.3 駐景丸加減方《中醫(yī)眼科六經(jīng)法要》混懸液的制備 藥物組成：楮實子10 g，菟絲子10 g，茺蔚子10 g，枸杞子 10 g，車前子 5 g，木瓜 10 g，寒水石10 g，河車粉 5 g，生三七 2 g，五味子 5 g。共 4 劑，均一次性購于長沙市芝靈大藥房。制備：用藥物總體積4倍量水浸泡 30 min，加熱煎煮 40 min，紗布（4～5層）濾取煎液，再用原藥物總體積2倍量水煎煮40 min，合并2次煎液，約300 mL，并加蒸餾水調(diào)整為1 g/mL，4℃儲存，備用。

1.1.4 試劑 戊巴比妥鈉：上?；瘜W試劑廠分裝，臨用時配制成3%戊巴比妥鈉溶液；一抗：NF-κB p65 rabbit polycloned IgG（產(chǎn)品代碼：bao0610）；購自武漢博士德公司；相應二抗及試劑盒：購自北京杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.5 儀器 電子秤：上海天平儀器廠生產(chǎn)，型號：JY0001；眼科顯微手術(shù)器械:蘇州醫(yī)療器械廠生產(chǎn)；勒克斯照度計：上海嘉定學聯(lián)儀器廠生產(chǎn)，型號：ZDS-10；眼科手術(shù)顯微鏡：蘇州醫(yī)療器械設備廠生產(chǎn)，型號：YZZOT；HHS-2型電子恒溫不銹鋼水浴鍋:上海南陽儀器有限公司生產(chǎn)；LEICA DM LB2型雙目顯微鏡：德國LEICA公司生產(chǎn)；S2-93型自動雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠生產(chǎn)；MoticB5顯微攝像系統(tǒng)：麥克奧迪實業(yè)集團公司生產(chǎn)；Image Pro Plus 6.0計算機圖像分析系統(tǒng)，美國2006年研發(fā)。以上相關(guān)器材及相關(guān)物品均由湖南中醫(yī)藥大學生理實驗室和眼科科研實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 動物購回馴養(yǎng)1周后，隨機分為：空白組(A)、模型組(B)、駐景丸組(C)、蠐螬低劑量組（D），蠐螬中劑量組（E），蠐螬高劑量組（F），每組 8只動物，16只眼。

1.2.2 造模方法 采用自制光化學損傷裝置：在光照架的6個面分別放置1根40W的白色熒光燈管。調(diào)節(jié)光照強度，并用ZDS-10型數(shù)字式照度計測定大鼠活動水平多點照度，平均為（2 000±200）1x。 動物房的室溫控制在21～24℃，光照箱內(nèi)的平均溫度為22～25℃。所有實驗動物在12 h明(30-50 1x)及12 h暗環(huán)境下循環(huán)光環(huán)境適應7 d，自由攝食飲水。7 d后光照前先暗適應24 h，然后光照12 h(晚上8:00至次日早上8:00)，再進行暗適應12 h，連續(xù)3個循環(huán)，光照時間總計為36 h。大鼠不散瞳及麻醉，可在光照箱內(nèi)自由活動，光照后送回暗環(huán)境中飼養(yǎng)。A組不施行光照試驗。

1.2.3 給藥劑量及方法 A組：給等容積蒸餾水灌胃；B組：分別給等容積蒸餾水灌胃；C組：成人日用量5倍劑量；D組：成人日用量5倍劑量；E組：10倍劑量；F組：20倍劑量。A組及B組每日以生理鹽水2 mL灌胃。給藥劑量按成人70 kg體表面積換算，用藥劑量 0.56 g／kg，相對應的 C、D、E、F 組給藥劑量分別為 2.8、2.8、5.6、11.2 g/kg。 每日灌胃 1 次，連續(xù)給藥2周后，光照造模7 d后繼續(xù)給藥1周。用2%戊巴比妥鈉0.2 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，12點鐘位縫線標記，立即摘除眼球(包括球后視神經(jīng)2 mm)，角膜穿通一小切口，浸泡于15%甲醛組織固定液中。24 h后沿標記縫線至視神經(jīng)連線對剖眼球，去除眼前節(jié)和玻璃體，逐級酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋，經(jīng)視乳頭顳側(cè)旁開1 mm縱向做4 μm厚的切片，烘干備用。

1.2.4 NF-κB免疫組化檢測 SP法：采用生物素標記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶染色及基質(zhì)素混合液來測定細胞和組織中的抗原。主要染色過程如下：石蠟切片脫蠟至水，用PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)沖洗 5 min×3 次。 3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min。蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。10%的正常山羊血清 (PBS稀釋)封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加1∶100比例稀釋的一抗，37 ℃孵育 1 h。PBS沖洗，5 min×3次。滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次。滴加第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，置37℃孵育30 min。PBS沖洗，5 min×3次。DAB顯色劑顯色。自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片。在10×10低倍視野下進行全面觀察，尋找視網(wǎng)膜內(nèi)NF-κB陽性物質(zhì)和核轉(zhuǎn)位細胞數(shù)最豐富區(qū)域(即“熱點”區(qū)，染色顏色最深/或染色面積最多)，然后在10×40倍視野下選擇5個熱點區(qū)，采用圖形分析系統(tǒng)定量測量指標陽性積分光密度和計數(shù)細胞核陽性的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 13.0軟件進行分析。多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗(SNK法)，相關(guān)性分析用Bivariate分析。各項指標均以 “”表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 蠐螬對大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達的影響

A組視網(wǎng)膜外核層細胞中NF-κB陽性物質(zhì)彌漫分布，含量較多，呈棕黃色細顆粒狀。B組視網(wǎng)膜外核層細胞中NF-κB陽性物質(zhì)分布稀疏，含量較少，呈淡黃色細顆粒狀。蠐螬各組和C組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中NF-κB陽性物質(zhì)有不同程度增加，積分光密度結(jié)果見表1，圖1。

2.2 蠐螬對大鼠視網(wǎng)膜NF-κB核轉(zhuǎn)位的影響

A組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中未見NF-κB核轉(zhuǎn)位陽性物質(zhì)分布，B組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中NF-κB核轉(zhuǎn)位陽性物質(zhì)含量少，蠐螬各劑量組和C組視網(wǎng)膜外核層細胞漿中NF-κB核轉(zhuǎn)位陽性物質(zhì)有不同程度增多，彌漫分布，呈棕黃色細顆粒狀，結(jié)果見表2。

表1 各組間大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達的比較 （）

表1 各組間大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達的比較 （）

注：與A組比較*P＜0.05；與B組比較▲P＜0.05；與D組比較★P＜0.05。

組 別A組B組C組D組E組F組眼數(shù)（只） 藥物劑量(g/kg)888888— —2.8 2.8 5.6 11.2積分光密度（×105）7.46±1.27 4.59±1.06*5.96±1.14*▲★5.15±1.30*5.87±0.98*▲★5.91±1.01*▲★

圖1 蠐螬提取物對大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達影響的光鏡圖（×400）

表2 各組間大鼠視網(wǎng)膜NF-κB核轉(zhuǎn)位的比較 （）

表2 各組間大鼠視網(wǎng)膜NF-κB核轉(zhuǎn)位的比較 （）

注：與B組比較*P<0.05。

組別A組B組C組D組E組F組眼數(shù)（只）藥物劑量(g/kg)888888— —2.8 2.8 5.6 11.2核轉(zhuǎn)位總數(shù)(個)0 47 68 58 69 68核轉(zhuǎn)位均數(shù)(個)0 5.88±2.47 8.50±2.77*6.63±2.50 8.75±2.49*8.63±2.49*

3 討論

中醫(yī)沒有AMD的病名記載，根據(jù)其臨床癥狀，屬于“視瞻昏渺”、“視正反斜”等范疇。AMD是一種由多因素引起的疾病，其真正的病因還不清楚，可能與年齡、家族史、種族、抽煙、營養(yǎng)不良、中毒、藥物作用、免疫異常、光的慢性損傷等因素有關(guān)，也可能是以上多因素綜合作用結(jié)果。但慢性光損害及視網(wǎng)膜上皮細胞代謝功能衰退是比較公認的。

蠐螬古文獻收錄為藥用，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主惡血血瘀痹氣，破折血在脅下堅滿痛，月閉，目中淫膚，青翳白膜?！苯陙硌芯勘砻飨擉└缓⒘吭?、氨基酸及維生素，有提高機體免疫力、抑制增殖、抗氧化、抗衰老、保護視網(wǎng)膜視神經(jīng)細胞等作用[5-9]。Sen等首次從鼠B淋巴細胞核提取物中，發(fā)現(xiàn)一種能與免疫球蛋白κ輕鏈基因增強子κB序列(GGGACTTTCC)特異結(jié)合，調(diào)節(jié)其基因表達的核蛋白因子，稱之為核因子κB?，F(xiàn)已清楚，在視網(wǎng)膜光化學損傷中，NF-κB體系能阻斷凋亡信號的傳遞，保護感光細胞，是抗凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子。另外，用突變型I-κB與NF-κB結(jié)合以后抑制其核轉(zhuǎn)移，可抑制光損傷所致的細胞凋亡，說明NF-κB在此病理過程中對光感受器細胞起重要的保護作用。

在本研究中，發(fā)現(xiàn)B組NF-κB積分光密度及NF-κB核轉(zhuǎn)位數(shù)少，E、F劑量組NF-κB積分光密度及NF-κB核轉(zhuǎn)位數(shù)增加。表明視網(wǎng)膜光損傷后NF-κB 含量減低，NF-κB 核轉(zhuǎn)位數(shù)減少，E、F 劑量組NF-κB含量增加，NF-κB核轉(zhuǎn)位數(shù)增加，提示蠐螬可能通過活化NF-κB信號通路，有效地減輕光損傷誘發(fā)的光感受器細胞的凋亡，從而發(fā)揮防護作用。

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（本文編輯 彭芝配）

Effects of grub extracts on the expression of NF-κB and its nuclear translocation in rats'retinal degeneration by light damage

WU Da-li1,2， TAN Han-yu1， PENG Qing-hua1
(1.Key discipline of Ophthalmology， First Affiliated Hosipital， TCM Universtiy of Hunan，Changsha，Hunan 410007， China;2.TCM College of Guangxi， Nanning， Guangxi 530001， China)

Objective To discuss the effects of grub extracts on the expressions of NF-κB and its nuclear translocation in rats'retinal degeneration by light damage.Methods 48 rabbits were randomly divided into 6 groups as follows：blank group,model group,Zhujing pill group and grub extracts low,middle,high dosage group，8 rabbits with 16 eyes in each group.Except for the blank group,the others were made retinal degeneration model by light damage.After treated for 3 weeks,all rabbits were taken specimen to check NF-κB expression levels by immnohistochemistry.Results were analyzed by computer image system.Results Compared with the model group，optical density of NF -κB and the numbers of nuclear translocation in middlle and high dosage grub group were increased significantly(P＜0.05).Conclusion Grub can inhibit apotosis receptor signal pathway to protect retina by activating NF-κB signal pathway.

grub extracts； light damage； nuclear factor-kappa B； nuclear translocation； rat

*譚涵宇，在讀博士研究生，講師，E-mail：thy612@126.com；彭清華，醫(yī)學博士，教授、主任醫(yī)師、博士研究生導師，E-mail：pqh410007@126.com。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.008.035.04

2011－12－29

湖南省教育廳科研基金資助項目（09C729）；湖南省衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科研基金資助項目（2010012）；國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)眼科學重點學科建設項目；湖南省中醫(yī)五官科學重點學科建設項目。

吳大力（1967-），男，湖南株州人，醫(yī)學博士，主要從事中醫(yī)藥治療眼底疾病的研究。