黃小平，陳 剛，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

三七總皂苷對大鼠血管平滑肌細胞增殖模型細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響

黃小平，陳 剛，鄧常清*

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208）

目的 研究三七總皂苷(TPNS)對大鼠血管平滑肌細胞（VSMC）增殖細胞周期相關(guān)蛋白表達的影響。方法以血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）誘導(dǎo)大鼠VSMC，觀察含藥血漿對VSMC增殖的影響，以免疫熒光流式細胞術(shù)測定增殖細胞核抗原（PCNA）及細胞周期相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果 血小板衍生生長因子（PDGF）剌激VSMC后，VSMC PCNA、VSMC細胞周期蛋白D1（cyclinD1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）蛋白表達增強，細胞周期抑制因子P21蛋白表達下調(diào)。阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC PCNA、cyclinD1和CDK4蛋白表達增強及P21蛋白表達下調(diào)。TPNS與阿托伐他汀比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 PDGF剌激VSMC后，可促進細胞周期轉(zhuǎn)化，細胞增殖加快。阿托伐他汀、TPNS可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖，其作用可能是通過抑制了細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達，從而抑制了VSMC細胞周期轉(zhuǎn)化和增殖。

三七總皂苷；血管平滑肌細胞；大鼠；增殖細胞核抗原；細胞周期蛋白D1；細胞周期蛋白依賴性激酶4

三七總皂苷（Total Panax Notoginseng Saponin，TPNS）是從中藥五加科植物三七panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen干燥根中提取的皂苷類有效組分，其主要有效成分為人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1等。Lin等[1]的研究表明，TPNS可顯著抑制高脂血清對VSMC的促增殖作用。研究表明，在大鼠主動脈球囊損傷血管內(nèi)膜增生模型，TPNS可抑制血管內(nèi)膜增生，抑制VSMC過度增殖，具有抗血管再狹窄的作用[2-3]。但TPNS抗血管再狹窄的機制還不清楚。由于VSMC在血管增殖性病變中具有重要的地位，為進一步闡明其作用機制，本研究采用血小板衍生生長因子（PDGF）誘導(dǎo)的VSMC增殖模型，研究TPNS抗VSMC增殖的作用及其細胞周期調(diào)控機制?，F(xiàn)將實驗方法及結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Sprague-Dawley大鼠由湖南省衛(wèi)生防疫站實驗動物中心提供。體質(zhì)量120～150 g，雌雄各半。合格證號：醫(yī)動字第20-010號。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫18～20℃，濕度65%～70%，自由飲水進食。

1.1.2 藥物 TPNS購自廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，批號:071119。TPNS系從三七（panax notoginsen）中提取的皂苷類活性成分[3]。以高效液相色譜法測定TPNS主要有效成分的含量[3]，含人參皂苷Rg150.4%，人參皂苷Rb130.9%，三七皂苷R112.5%。阿托伐他?。╝torvastatin），規(guī)格 10 mg/片，Godecke GmbH生產(chǎn)，輝瑞制藥有限公司分裝，批號:080117。臨用時以去離子蒸餾水配成2 mg/mL混懸液。

1.1.3 試劑 杜爾伯科改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胰蛋白酶(1∶250)購自美國Gibico公司；DMEM培養(yǎng)基以超純水配制，過濾除菌，-20℃保存；胎牛血清(FCS)購自杭州四季青試劑公司，56℃滅活補體30 min，過濾除菌后分裝，-20℃保存。血小板衍生生長因子-BB（PDGF-BB）、碘化丙啶（Propidium iodide，PI)、二甲基亞砜（DMSO）等均購自 Sigma 公司；其余試劑均為分析純。抗增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA） 抗體和抗 p21蛋白抗體，為小鼠抗大鼠單克隆抗體，購自Santa Cruz公司；抗CDK4抗體和抗β-actin抗體為小鼠抗大鼠多克隆抗體，購自北京博奧森生物試劑公司；第二抗體異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗小鼠抗體用于 PCNA、cyclinD1、P21、CDK4 的測定，第二抗體HRP標(biāo)記的兔抗小鼠抗體用于β-actin的測定。以上二抗均購自Amersham公司。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（產(chǎn)地：美國,型號：SHEL-LAB2300）；流式細胞儀（美國產(chǎn)，型號：FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠主動脈平滑肌細胞培養(yǎng)和鑒定 原代細胞培養(yǎng)：采用組織貼塊法培養(yǎng)[4]。傳代培養(yǎng)取原代生長的 VSMC，以 Hank’s液洗滌后，以 0.25%胰蛋白酶消化，以 FCS終止反應(yīng)，DMEM 培養(yǎng)基洗滌后，以含20%FCS的DMEM培養(yǎng)基制成1×106/mL細胞懸液進行傳代培養(yǎng)。細胞鑒定:倒置顯微鏡下，培養(yǎng)的VSMC貼壁生長，細胞呈長梭形，放射性生長，細胞質(zhì)透明，相互融合在一起。成束的細胞平行排列，呈鋪路石樣“峰-谷”狀生長。用免疫細胞化學(xué)法測定VSMC的SMα-actin表達，可見到VSMC胞漿中SMα-actin呈陽性表達。實驗用VSMC 4-6代傳代細胞。

1.2.2 含藥血漿的制備 按文獻方法[5]，將大鼠隨機分為空白組、TPNS（200 mg/kg）組和阿托伐他?。?0 mg/kg）組。每組10～12只?？瞻捉M灌胃等量蒸餾水（給藥體積為10 mL/kg），各給藥組分別灌胃藥物。每天給藥2次，分別在上午9時和下午4時。連續(xù)灌胃7次后，于末次給藥2 h后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸總動脈取血，以1.5%乙二胺四乙酸（EDTA）-Na2 抗凝（血液∶抗凝劑=9∶1），在 4 ℃3 000 r/min離心15 min，取血漿，將各給藥組各鼠血漿等量混合即為含藥血漿，空白組各鼠血漿等量混合即為空白血漿，除菌后分裝，-70℃保存。

1.2.3 VSMC細胞周期及相關(guān)蛋白表達的測定 根據(jù)以往研究[6]，空白血漿濃度為10%，細胞培養(yǎng)24 h，對VSMC增殖的抑制率為8%，TPNS含藥血漿和阿托伐他汀含藥血漿對PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMC增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）均為（13±3）%，故設(shè)定空白血漿和含藥血漿的終濃度均為10%。將培養(yǎng)細胞分為無血漿空白對照組、PDGF刺激組、空白血漿組、TPNS含藥血漿組、阿托伐他汀含藥血漿組，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞生長同步化于G0期，然后分別加入各含藥血漿（終濃度10%），3 h后加入PDGF-BB（終濃度 10 ng/mL），培養(yǎng) 24 h后測定。運用免疫熒光流式細胞分析術(shù)測定細胞周期相關(guān)蛋白CyclinD1、CDK4、P21和增殖相關(guān)蛋白 PCNA的表達。 取 1×106／mL細胞懸液 1mL， 加入 80%乙醇1 mL-20℃放置2 h，用PBS液洗滌后加入0.25%Triton X-100冰浴5 min， 樣品管加一抗（1∶100）20 μL，避光4℃過夜，PBS洗滌后加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠多克隆抗體（1∶40），37℃避光30 min后加入含PI（10 g/L）和0.1%核糖核酸酶A的PBS緩沖液 1 mL避光37℃ 30 min。采用流式細胞儀檢測，激發(fā)光波長為506 nm，發(fā)射光波長為526 nm，以平均熒光強度值（MFI）反映所測蛋白表達的相對量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 各組細胞周期相關(guān)蛋白表達比較的柱狀圖（，n=5）

2 結(jié)果

與無血漿空白組比較，PDGF刺激組CyclinD1、CDK4、PCNA 蛋白表達均顯著增強（P<0.01），P21 蛋白表達顯著降低（P<0.01）。空白血漿組CyclinD1、CDK4、PCNA表達均顯著高于無血漿空白組（P<0.01），但表達均低于 PDGF 刺激組（P<0.05）；空白血漿組P21表達也顯著低于無血漿空白組（P<0.01），但略高于 PDGF 刺激組（P<0.05）。 TPNS含藥血漿組和阿托伐他汀含藥血漿組與空白血漿組比較，CyclinD1、CDK4、PCNA 表達均顯著降低（P<0.01），P21 表達均顯著增高（P<0.01）。但各含藥血漿組與無血漿空白組比較，CyclinD1、CDK4、PCNA 表達均升高（P<0.05），P21 表達降低（P<0.05）。 而兩個含藥血漿組之間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。（P>0.05）。見圖 1。

3 討論

VSMC的異常增殖是血管增殖性疾病發(fā)生的重要因素。已有研究表明，血管緊張素受體拮抗劑、降血脂藥羥甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶抑制劑等可對抗VSMC增殖，延緩血管增生性病變的發(fā)生[7-8]。進一步開展中藥及其有效成分抗血管再狹窄的研究，從中尋找確有效應(yīng)的中藥及其成分，這對于提高血管增殖性病變防治的療效具有重要的意

生長因子作用于VSMC膜受體，激活細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致核內(nèi)基因表達，從而調(diào)控VSMC的增殖。血小板衍生生長因子（PDGF）等為刺激VSMC增殖的主要生長因子。PDGF家族成員有PDGF-A、B、C、D。 PDGF-BB 能刺激多種細胞如VSMC、成纖維細胞、膠質(zhì)細胞的分裂增生，促進DNA合成和細胞分裂、增殖[9]，常作為促VSMC增殖的生長因子使用。故在本研究中，以PDGF-BB刺激VSMC增殖為本研究的模型。

PCNA是一種與細胞增殖有關(guān)的參與DNA合成的核蛋白，僅能在增殖細胞中合成和表達，是S期的特異性標(biāo)記，其表達水平與細胞增殖程度成正比[10]。本研究表明，PDGF剌激后，PCNA表達增強。表明在PDGF剌激后，VSMC增殖增快。與PDGF剌激組比較，空白血漿可使PCNA表達降低，這可能是血漿中含有的抗凝劑EDTA-Na2對細胞的影響所致。陽性對照藥阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC PCNA表達，表明二者對PDGF誘導(dǎo)的VSMC增殖具有抑制作用。

細胞增殖取決于細胞在細胞外信號的作用下，細胞周期的有序進展。細胞周期主要依次由G1、S、G2和M 4個期組成。其存在兩個限制點，決定細胞是否繼續(xù)增殖或進入靜止?fàn)顟B(tài):一個限制點在DNA合成的開始即G1-S限制點，另一個在有絲分裂開始，即G2-M限制點，其中G1-S限制點更為重要，是生長因子及細胞外刺激作用的位點。G1-S限制點主要被一系列細胞周期蛋白（Cyclins）和細胞周期蛋白依賴激酶（CDK）調(diào)控，其中主要為Cyclin D/CDK4、CDK6 和 Cyclin E/CDK2 等[11-12]， 它 們 在VSMC由非增殖狀態(tài)向增殖狀態(tài)的轉(zhuǎn)變過程中起決定性作用。cyclin D包括D1、D2、D3，作用類似于生長因子傳感器，將細胞外的信號與細胞周期的進行連接在一起，是CDK的活性輔助因子，cyclinD/CDK4(或 CDK6)對 G1/S轉(zhuǎn)換是必需的[13]。P21和P27蛋白屬細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（CKI）家族，主要抑制G1-S限制點中的各種周期蛋白及CDK，使細胞停滯于G0-G1期。研究表明，P21、P27蛋白與VSMC增殖呈負相關(guān)[14]。

本實驗結(jié)果表明，PDGF剌激后，培養(yǎng)VSMC cyclin D1和CDK4蛋白表達增強，P21蛋白表達下調(diào)，提示促進細胞周期轉(zhuǎn)換的調(diào)節(jié)因子活性增強，抑制因子活性降低，從而促進了細胞周期轉(zhuǎn)化。空白血漿也可使cyclinD1和CDK4蛋白表達輕度下調(diào)，P21蛋白表達輕度上調(diào)，可能與血漿中的抗凝劑EDTANa2的影響有關(guān)。阿托伐他汀含藥血漿和TPNS含藥血漿均可抑制PDGF誘導(dǎo)的VSMC cyclinD1和CDK4蛋白表達增強及P21蛋白表達下調(diào)，表明二者對細胞周期轉(zhuǎn)化的抑制作用與下調(diào)cyclinD1和CDK4蛋白表達及上調(diào)P21蛋白表達有關(guān)。

[1]Lin S G， Zheng X L， Chen QY， et al.Effect of Panax notoginseng saponins on increased proliferation of cultured aortic smooth muscle cells stimulated by hypercholesterolemic serum[J].Acta pharmacologica Sinica， 1993，14(4):314-316.

[2]陳瑞芬，鄧常清.三七總皂苷對大鼠血管內(nèi)膜增生細胞周期蛋白表達的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，29(4):11-14.

[3]Wu L，Zhang W，Tang YH，et al.Effect of Total Saponins of “Panax Notoginseng root” on aortic intimal hyperplasia and the expressions of cell cycle protein and extracellular matrix in rats[J].Phytomedicine， 2010，17(3-4):233-240.

[4]Rodríguez A， Fortuo A， Gómez-Ambrosi J， et al.The inhibitory effect of leptin on angiotensinⅡ-induced vasoconstriction in vascular smooth muscle cells is mediated via a nitric oxide-dependent mechanism[J].Endocrinology， 2007，148(1):324-331.

[5]Ma Q L， Sun M， Yang T L， et al.Effects of Tongxinluo on cell viability and tissue factor in AngⅡinduced vascular endothelial cell[J].Journal of Central South University(Medical Sciences)， 2007，32(3):485-488.

[6]李 花，陳 剛，鄧常清.補陽還五湯及其有效組分和三七總皂苷含藥血漿抗血小板衍生生長因子誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖的作用[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2009，7(11):1 078-1 085.

[7]Walter D H，Schchinger V，Elsner M，et al.Effect of statin therapy on restenosis after coronary stent implantation[J].The American Journal of Cardiology， 2000，85(8):962-968.

[8]Peters S， G?tting B， Trümmel M， et al.Valsartan for prevention of restenosis after stenting of type B2/C lesions:the VALPREST trial[J].The Journal of Invasive Cardiology， 2001，13(2):93-97.

[9]Dandré F， Owens G K.Platelet-derived growth factor-BB and Ets-1 transcription factor negatively regulate transcription of multiple smooth muscle cell differentiation marker genes[J].American Journal of Physiology.Heart and Circulatory Physiology， 2004，286(6)：2 042-2 051.

[10]Miniati D N， Hoyt E G， Feeley B T， et al.Ex vivo antisense oligonucleotides to proliferating cell nuclear antigen and Cdc2 kinase inhibit graft coronary artery disease[J].Circulation， 2000，102(19 Suppl 3):Ⅲ 237-Ⅲ 242.

[11]Pines J.Cyclins and cyclin-dependent kinases:a biochemical view[J].The Biochemical Journal， 1995，308(Pt3):697-711.

[12]Cheng Y， Liu P， Chen H， et al.Antiproliferative effects of trapidil in vascular smooth muscle cells are associated by inhibition of MAPK and P34(cdc2)activity[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2000，35(1):1-6.

[13]Braun-Dullaeus R C， Mann M J， Dzau V J.Cell cycle progression: new therapeutic target for vascular proliferative disease[J].Circulation， 1998，98(1):82-89.

[14]Coats S， Flanagan W M， Nourse J， et al.Requirement of p27Kip1 for restriction point control of the fibroblast cell cycle[J].Science， 1996，272(5263):877-880.

（本文編輯 彭芝配）

Effects of total Panax notoginseng saponins on the expression of cell cycle-related proteins of rat vascular smooth muscle cells proliferation model

HUANG Xiao-ping， CHEN gang， DENG Chang-qing
(TCM University of Hunan， Changsha， Hunan 410208， China)

Objective To discuss the impacts of total Panax notoginseng saponin(TPNS)on the cell cycle-related protein in the proliferation of vascular smooth muscle cells(VSMCs)proliferating model induced by platelet-derived growth factor(PDGF).Methods A VSMC proliferating model was established induced by PDGF-BB and the effects of rat plasma containing drugs on the VSMC proliferation were observed. The expressions of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)and cell cycle-related proteins were determined with flow cytometry.Results After being stimulated by PDGF,up-regulation of PCNA,cyclinD1,cyclin-dependent kinase-4(CDK4)and down-regulation of p21 protein in VSMCs were observed.These changes were inhibited by atorvastatin and TPNS drug-containing plasma，and these effects in both groups were not significant（P>0.05）.Conclusion PDGF can promote cell cycle conversion and quicken proliferation of VSMCs.Atorvastatin and TPNS maybe inhibit effectively the VSMC proliferation induced by PDGF with suppressing the expression of cell cycle-related proteins.

Total Panax notoginseng saponin；vascular smooth muscle cell；rat；proliferating cell nuclear antigen；cyclin D1；cyclin-dependent kinase 4

*鄧常清，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail:dchangq@yahoo.cn。

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674－070X.2012.05.004.021.04

2012－02－19

國家自然科學(xué)基金資助項目（30572301）。

黃小平（1974-），女，湖南常德人，醫(yī)學(xué)碩士，講師，主要從事心腦血管疾病的研究。