吳海濱 張樂(lè)鳴

胃癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤，位居腫瘤死因和常見(jiàn)腫瘤的第2位和第4位［1］。目前，外科手術(shù)和抗腫瘤治療未能改善胃腺癌的不良預(yù)后，5年生存率僅是5% ～17%，其浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的主要因素［2］。幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，H．pylori)已經(jīng)被確認(rèn)為胃癌的重要病因之一，其與胃癌的不良預(yù)后相關(guān)。研究顯示幽門(mén)螺桿菌陽(yáng)性的胃癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明幽門(mén)螺桿菌能促進(jìn)胃癌的肺轉(zhuǎn)移［3，4］。長(zhǎng)期隨訪研究顯示根除幽門(mén)螺桿菌可逆轉(zhuǎn)胃癌癌前病變，提示幽門(mén)螺桿菌有促進(jìn)胃癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用［5］。魏軍等發(fā)現(xiàn)H．pylori-L型感染增強(qiáng)了胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［6］。目前H．pylori與胃癌侵襲轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不完全清楚。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移重要因子，HIF-1α和 HIF-2α可調(diào)控VEGF的表達(dá)，是惡性腫瘤誘導(dǎo)新生血管形成的主要調(diào)控因子。因此，我們把H．pylori與人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823共培養(yǎng)，觀察BGC-823細(xì)胞增殖情況并對(duì)HIF-1α、HIF-2α及VEGF表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，以探討幽門(mén)螺桿菌感染對(duì)胃癌侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響及可能誘導(dǎo)胃癌血管生成機(jī)制。

材料與方法

1．材料:RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶均購(gòu)自(GIBoC公司);胎牛血清(FCS，杭州四季青公司);5%四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT溶液，上海華美生物工程公司)，總RNA提取試劑Trizol(北京天根公司);MMIV第1鏈cDNA合成試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒(fermentas);1000bp DNA ladder及PCR引物由上海生物工程公司合成。微需氧產(chǎn)氣袋(oxoid公司);哥倫比亞血平板(梅里埃公司);兔抗人HIF-1α和HIF-2α抗體(Genetex公司);VEGF多克隆抗體(北京博奧森公司);HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自(北京博奧森公司);ECL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;RIPA蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天公司。H．pylori國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株(NCTC11637)由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng)，人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823購(gòu)自杭州澤衡生物科技有限公司。

2．方法:(1)細(xì)胞培養(yǎng):選用人胃腺癌細(xì)胞株BGC-823，在含10%FCS的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基中加青霉素100U/ml及鏈霉素100mg/ml，37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)。(2)H．pylori菌懸液的制備:在無(wú)菌條件下，以劃線培養(yǎng)方式將H．pylori接種于哥倫比亞血平板，置于37℃微需氧袋中培養(yǎng)，3～5天后收集針尖樣透明菌落，用PBS制成懸液，于分光光度計(jì)上調(diào)節(jié) H．pylori濃度至1×108CFU/ml(A660=l×108CFU/ml)，并將H．pylori菌液連續(xù)4次作10倍稀釋調(diào)節(jié)至(1×103CFU/ml、1 × 104CFU/ml、1 × 105CFU/ml、1 × 106CFU/ml和 1 ×107CFU/ml)。(3)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率:BGC-823細(xì)胞接種于5×105每孔含潔凈小蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔，過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的H．pylori懸液，其中加入 1 ×103CFU/ml、1 ×104CFU/ml、1 ×105CFU/ml、1 ×106CFU/ml和 l×107CFU/ml的 H．pylori活菌懸液分別稱為試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3、試驗(yàn)組4和試驗(yàn)組5，對(duì)照組加稀釋用培養(yǎng)液，每種細(xì)胞重復(fù)3孔。與BGC-823細(xì)胞共孵育12、24、36和48h后棄培養(yǎng)液，每孔加MTT 20μl(濃度為5mg/ml)，放置孵箱內(nèi)4h后棄上清加入10%的SDS 200μl，過(guò)夜。震蕩15min，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biorad公司)檢測(cè)570nm處的吸光度值(A值)。計(jì)算細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值。(4)H．pylori懸液和BGC-823細(xì)胞共培養(yǎng):①取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BGC-823細(xì)胞用含0．2g/L EDTA和1．5g/L胰蛋白酶消化后計(jì)數(shù)，接種于5×105每孔含潔凈小蓋玻片的12孔培養(yǎng)板中，過(guò)夜;②將稀釋好的H．Pylori活菌懸液加入過(guò)夜后貼壁的BGC-823細(xì)胞中，加入1×103CFU/ml、1 ×104CFU/ml、1 ×105CFU/ml的 H．Pylori活菌懸液分別稱為試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3，對(duì)照組加稀釋用培養(yǎng)液，每種細(xì)胞重復(fù)3孔;③培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，分別進(jìn)行RTPCR、Western blotting檢測(cè)。(5)RT-PCR 檢測(cè) HIF-1α，HIF-2α和VEGFmRNA的表達(dá):用RNA提取試劑Trizol提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)樣品濃度，瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，用MMLV第1鏈cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按說(shuō)明書(shū)操作。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)(95℃預(yù)變性 3min，94℃變性 1min，55℃復(fù)性 1min，72℃延伸 1min，30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min)。HIF-1α的引物上游為;5'AGCCGCTGGAGACACAAT-3'和下游為5'-TCGGAAGGACTAGGTGTCTGA-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為302bp;HIF-2α的引物上游為;5'-CCCTTCCTCCTGGACAAGTTTC-3'，下游為 5'-CCCTGAGGTTCTTCATCCGTTT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為490bp;VEGF的引物上游為:5'GCCTTGCTGCTCTACCTC-3'，下游為5'GGCACACAGGATGGCTTG-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度為200bp;內(nèi)對(duì)照β-actin的引物上游為:5'-ACGGCATCGTCACCAACT-3'和下游為5'-CAATGCCAGGGTACATGGT-3'，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 為 710bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1．5瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色顯示，用Quantity One凝膠圖像分析系統(tǒng)分析，以 HIF-1α、HIF-2α mRNA/β-actin mRNA電泳帶的吸光度比值作為HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量指標(biāo)。(6)Western blotting檢測(cè)HIF-1α，HIF-2α和VEGF蛋白表達(dá):棄培養(yǎng)液后PBS沖洗細(xì)胞3次，加入預(yù)冷的RIPA裂解液150μl，RIPA裂解液預(yù)先加PMSF 1．5μl使終濃度為1mmol/L。操作于冰上進(jìn)行，4℃下10000r/min(離心半徑為4cm)離心5min取上清液，BCA法測(cè)蛋白濃度后，99℃ 變性10min。取50μg蛋白行10%SDSPAGE電泳，半干法電轉(zhuǎn)移法100V恒壓電泳1h，將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。室溫下用脫脂奶粉封閉1h后加一抗(兔抗人HIF-1α、HIF-2α，和 VEGF多克隆抗體，工作濃度是1∶1000)，4℃孵育過(guò)夜，洗膜;加HRP標(biāo)記的二抗(羊抗兔 IgG抗體，工作濃度1∶1000)，37℃，孵育 1h，ECL 試劑于暗室自顯影。Western blotting圖像存入計(jì)算機(jī)，用ImageJ 1．44p圖像分析軟件包進(jìn)行光密度計(jì)算。

3．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:本研究采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，進(jìn)行ANOVA檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1．MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率:MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1，表1，BGC-823細(xì)胞與低濃度的H．pylori懸液(1×103CFU/ml、1×104CFU/ml和 1×105CFU/ml)共孵育 12、24、36、48h 后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。與高濃度的 H．pylori懸液(1 ×106CFU/ml和1 ×107CFU/ml)共孵育 12、24、36、48h 后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

圖1 BGC-823細(xì)胞與不同濃度的H．pylori懸液共孵育后細(xì)胞存活曲線(MTT法)

2．BGC-823細(xì)胞 HIF-1α 、HIF-2α 及 VEGF mRNA的表達(dá):RT-PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖2，mRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表2。表2顯示，H．pylori刺激24h后，對(duì)照組和試驗(yàn)組比較，試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3與對(duì)照組比較條帶明顯變寬，試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3與對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。隨著試驗(yàn)組H．pylori濃度的增加，條帶逐漸變寬。

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(%，±s，n=3)

表1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率(%，±s，n=3)

時(shí)間(h)細(xì)胞存活率(%)實(shí)驗(yàn)組1 實(shí)驗(yàn)組2 實(shí)驗(yàn)組3 實(shí)驗(yàn)組4 實(shí)驗(yàn)組5 12 110．33 ±2．51 120．33 ±1．53 133．67 ±2．51 81．67 ±153 64．33 ±4．16 24 124．67 ±4．16 134．67 ±4．16 155．67 ±2．52 45．67 ±4．16 32．33 ±1．53 36 146．330 ±3．78 154．67 ±4．16 176．33 ±1．53 19．33 ±1．53 14．67 ±1．53 48 174．67 ±1．52 196．67 ±1．52 225．33 ±1．52 9．33±1．52 2．67 ±0．58

圖2 RT-PCR檢測(cè)

表2 HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s，n=3)

表2 HIF-1α、HIF-2α及VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量(±s，n=3)

VEGF對(duì)照組組別 n HIF-1α HIF-2α 3 0．43 ±0．04 2．07 ±0．02 1．31 ±0．11實(shí)驗(yàn)組1 3 0．79 ±0．04 2．41 ±0．02 1．67 ±0．04實(shí)驗(yàn)組2 3 0．99 ±0．05 2．84 ±0．05 2．06 ±0．04實(shí)驗(yàn)組3 3 1．28 ±0．05 3．14 ±0．09 2．39 ±0．06

3．BGC-823細(xì)胞 HIF-1α 、HIF-2α 及 VEGF蛋白的表達(dá):Western blotting檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3、表3。表3顯示H．pylori刺激24h后，對(duì)照組和試驗(yàn)組比較，試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2和試驗(yàn)組3與對(duì)照組比較條帶明顯變寬，試驗(yàn)組1、試驗(yàn)組2、試驗(yàn)組3和對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。隨著試驗(yàn)組H．pylori濃度的增加，條帶逐漸變寬。

圖3 Western blotting檢測(cè)BGC-823細(xì)胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達(dá)

表3 各組BGC-823細(xì)胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達(dá)(±s，n=3)

表3 各組BGC-823細(xì)胞HIF-1α、HIF-2α及VEGF蛋白的表達(dá)(±s，n=3)

VEGF對(duì)照組組別 n HIF-1α HIF-2α 3 0．22 ±0．02 0．43 ±0．05 0．181 ±0．03實(shí)驗(yàn)組1 3 0．39 ±0．01 0．81 ±0．03 0．545 ±0．01實(shí)驗(yàn)組2 3 0．81 ±0．01 1．05 ±0．12 0．874 ±0．04實(shí)驗(yàn)組3 3 1．08 ±0．15 1．37 ±0．08 1．153 ±0．06

討 論

有研究報(bào)道AGS細(xì)胞與H．pylori活菌上清活菌體破裂物共培養(yǎng)后，其增殖速度加快，表明H．pylori活菌與胃癌增殖具有相關(guān)性。吳海波等研究發(fā)現(xiàn)H．pylori-L型作用BGC-823細(xì)胞后，細(xì)胞分裂增多，增殖旺盛，瘤巨細(xì)胞增多，出現(xiàn)明顯的生長(zhǎng)加速現(xiàn)象［7］。吳鶯等［8］研究發(fā)現(xiàn) H．pylori超聲提取液可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞BGC-823細(xì)胞出現(xiàn)蜂鳥(niǎo)表型，凋亡抑制基因Survivin mRNA表達(dá)上調(diào)、凋亡基因caspase-3 mRNA表達(dá)下降，表明H．pylori可能通過(guò)上調(diào)凋亡抑制基因survivin、下降凋亡基因caspase-3的表達(dá)來(lái)促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)H．pylori懸液濃度在低濃度(1×103CFU/ml、1×104CFU/ml和1×105CFU/ml)時(shí)能顯著促進(jìn)BGC-823細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，BGC-823細(xì)胞的增殖呈增高趨勢(shì)，而高濃度的H．pylori懸液(1×106CFU/ml和1×107CFU/ml)顯著抑制BGC-823細(xì)胞的增殖，且隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，BGC-823細(xì)胞的抑制呈增高趨勢(shì)，說(shuō)明H．pylori感染濃度和時(shí)間可能對(duì)胃癌的生長(zhǎng)起重要作用。因此，我們選擇低濃度的H．pylori懸液與BGC-823細(xì)胞共培養(yǎng)24h后，檢測(cè) HIF-1α、HIF-2α及VEGF表達(dá)情況。

有研究發(fā)現(xiàn)，H．pylori陽(yáng)性的胃癌細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)比H．pylori陰性的胃癌細(xì)胞過(guò)表達(dá)，并表現(xiàn)出更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力［9，10］。而腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的過(guò)程與新生血管生成密切相關(guān)，腫瘤的生長(zhǎng)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移依賴于血管生成，VEGF是腫瘤誘導(dǎo)產(chǎn)生新生血管的最重要的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示H．pylori感染人胃癌細(xì)胞BGC-823 24h后VEGF過(guò)表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著 H．pylori濃度的增加，VEGF呈增高趨勢(shì)，提示H．pylori感染可能通過(guò)刺激VEGF表達(dá)而影響腫瘤新生血管的生成，從增加胃癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移能力。

腫瘤血管的生成需要促血管生成因子的作用，研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α和HIF-2α是重要的促血管生成因子，HIF-1α和HIF-2α可調(diào)控VEGF的表達(dá)。研究證實(shí)缺氧或某些基因突變可活化HIF-1α與VEGF基因的調(diào)控序列相結(jié)合，從而啟動(dòng)VEGF的轉(zhuǎn)錄。而本研究中，H．pylori感染人胃腺癌細(xì)胞BGC-823 24h后可顯著提高HIF-1α mRNA和蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著H．pylori濃度的增加，HIF-1α表達(dá)呈增高趨勢(shì)。提示VEGF的表達(dá)可能是H．pylori通過(guò)HIF-1α途徑來(lái)調(diào)控的。馮玉光等在尼美舒利對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)的BGC-823細(xì)胞HIF-1α及VEGF表達(dá)的影響是發(fā)現(xiàn)，氯化鈷刺激BGC-823細(xì)胞24h，可顯著提高細(xì)胞HIF-1α蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表達(dá)(P＜0．01)，但對(duì) HIF-1αmRNA 表達(dá)無(wú)影響［11］。而本實(shí)驗(yàn)證實(shí) H．pylori可能通過(guò)HIF-1α在基因水平和蛋白水平調(diào)控VEGF表達(dá)。

Song等［12］在研究胃癌血管生成和糖代謝相關(guān)的靶基因的調(diào)節(jié)時(shí)發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)缺氧時(shí)胃癌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和葡萄糖代謝相關(guān)基因表達(dá)的是HIF-1α和HIF-1β，而不是 HIF-2α。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn) H．pylori感染人胃癌細(xì)胞BGC-823 24h后可顯著提高HIF-2αmRNA和蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，并且隨著 H．pylori濃度的增加，HIF-2α 呈增高趨勢(shì)。提示H．pylori增強(qiáng)VEGF的表達(dá)也可能是通過(guò)增加HIF-2α來(lái)調(diào)控的，且HIF-2α可能是在基因水平和蛋白水平調(diào)控VEGF表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度的H．pylori懸液可顯著增加胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖，并能提高HIF-1α、HIF-2α和VEGF表達(dá)，這可能是H．pylori促進(jìn)胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一。本研究結(jié)果為臨床上針對(duì)H．pylori抗陽(yáng)性的胃癌病人，根除H．pylori降低胃癌細(xì)胞增殖速度，減少HIF-1α、HIF-2α和VEGF表達(dá)，對(duì)控制胃癌細(xì)胞增殖速度和胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移有一定的指導(dǎo)意義。也為針對(duì)HIF-1α、HIF-2α和VEGF等抗胃癌血管生成的靶向治療提供初步的理論依據(jù)。目前，已提出了針對(duì)HIF-1α轉(zhuǎn)錄翻譯、上游信號(hào)活化、信號(hào)傳導(dǎo)通路、下游效應(yīng)分子等新靶向HIF-1α轉(zhuǎn)錄因子治療胃癌的新思路［13］。由于HIF-2α在腫瘤組織和血管內(nèi)皮的表達(dá)比HIF-1α更強(qiáng)烈，以HIF-2α為靶點(diǎn)的抗血管生成治療與HIF-1α和傳統(tǒng)細(xì)胞毒藥物、腫瘤免疫療法相結(jié)合的治療方法，有望在H．pylori陽(yáng)性的胃癌患者在治療上有所突破。

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