王全富，侯艷華，藺一飛，李富超

（1.哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，山東威海264209；3.中國科學(xué)院海洋研究所實驗海洋生物學(xué)開放研究實驗室，山東青島266071）

深海及深海沉積物中微生物的生存面臨高壓，低溫或高溫、黑暗及低營養(yǎng)水平等幾個主要極端環(huán)境，經(jīng)過長期的自然選擇，形成了極為特殊的生理結(jié)構(gòu)和代謝機制。因此深海微生物的多樣性和資源開發(fā)受到越來越多的關(guān)注，有許多新藥物和新酶等資源正有待于研究和開發(fā)[1]。脂肪酶作為廣泛應(yīng)用的一種工業(yè)用酶，目前使用的基本都是中溫酶，酶活性最適溫度一般都在50 ℃左右。同中溫酶相比，低溫酶在工業(yè)應(yīng)用上有以下優(yōu)勢：通過溫和的熱處理使低溫酶失活，快速而經(jīng)濟地終止反應(yīng)；生產(chǎn)過程在低溫或室溫下進(jìn)行，無需加熱和冷卻，可以降低成本；生產(chǎn)過程便于監(jiān)控。因此，低溫脂肪酶在食品工業(yè)領(lǐng)域中得到越來越廣泛的應(yīng)用，如在酒類釀造、奶酪的批量生產(chǎn)、面包加工、肉類軟化和食品添加劑等方面[2]。由于深海微生物采樣、分離培養(yǎng)等多種因素的影響，國內(nèi)外對深海微生物的研究還處于起步階段。本研究通過從鄂霍次克海域深海沉積物中分離篩選高產(chǎn)胞外脂肪酶的菌株，對其進(jìn)行16 S rRNA 分子鑒定，并對酶學(xué)性質(zhì)予以初步研究，為深海微生物酶資源在食品工業(yè)上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

深海沉積物樣品采集于由俄、韓、日、中四國共同組織的“海底冷泉與生命過程”聯(lián)合調(diào)查航次（2006年5月），深海微生物依常規(guī)沉積物的菌種稀釋方法從鄂霍次克海域采獲沉積物柱狀樣品（lv39-06-06-04-18H）中分離獲得。

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

篩選培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 30 g，MgSO41 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO42 g，Tween80 10 mL，海水1 000 mL。10 ℃下150 r/min 搖床培養(yǎng)4 d，測其脂肪酶活性。

1.3 脂肪酶酶活力的測定

脂肪酶酶活力測定采用NaOH 滴定法進(jìn)行。在溫度為35 ℃，反應(yīng)時間為30 min 的條件下，每分鐘水解脂肪產(chǎn)生1 μmol 脂肪酸所需的酶量定義為一個脂肪酶活性單位（U）。

1.4 16S rRNA 基因序列測定與系統(tǒng)發(fā)育樹分析

1.4.1 細(xì)菌總DNA 的提取

按照CTAB 方法[3]。

1.4.2 16S rRNA 基因序列的PCR 擴增

采用細(xì)菌16S rRNA 基因的通用引物，引物序列為：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，包括：1×PCR 緩沖液，1.6 mmol/L MgCl2，4×dNTP 混合物各100 μmol/L，引物各1.0 μmol/L，Taq DNA 聚合酶1個單位，模板DNA 1 μL。PCR 反應(yīng)條件為：93 ℃，5 min；93 ℃，1 min；52 ℃，1 min；72 ℃，1 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.4.3 16S rRNA 基因文庫的構(gòu)建

以上海華舜DNA 純化試劑盒對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，克隆到pMD18-T 質(zhì)粒載體上，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10 感受態(tài)細(xì)胞，然后進(jìn)行陽性克隆的篩選；用北京賽百盛質(zhì)粒純化試劑盒提取陽性克隆的質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定；酶切成功的質(zhì)粒送交上海華大基因測序公司完成測序工作。測序引物為通用引物。

1.4.4 16S rRNA 基因序列測定與系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系的分析

將所測定菌株130（EU913789）的16S rRNA 基因序列（大約1.3Kb），同GenBank 數(shù)據(jù)庫中選取的與菌株親源關(guān)系較近16S rRNA 基因序列，用BioEdit 軟件的多序列比對排列（Clustalw multiple alignment）進(jìn)行序列比對；用DNAStar 軟件進(jìn)行序列相似性比較；系統(tǒng)發(fā)育分析采用Mega2 軟件的鄰接法（neighborjoining method）進(jìn)行；通過自舉分析（boot-strap）進(jìn)行置信度檢測，自舉數(shù)據(jù)集為1 000 次。

1.5 脂肪酶酶活特性的測定

1.5.1 最適溫度測定

設(shè)置0、10、20、30、35、40、45、50、60 ℃9 個溫度梯度，測定不同溫度下的酶活力，以確定其最適溫度。

1.5.2 最適pH 測定

將酶在各pH 緩沖液NaAC/HAC（pH 5.0）；KH2PO4/Na2HPO4（pH6.0，7.0）；Tris-HCl （pH 8.0，9.0）；Na2HPO4/NaOH（pH 10.0，11.0）中于4 ℃保存2 h 后，測其脂肪酶活性。

1.5.3 熱穩(wěn)定性測定

將酶液分別在30、40、50、60 ℃4 個溫度條件下依次保溫10、20、30、40 min，然后放入冰水混合物中，與未被保溫處理的酶活性相比較，測其脂肪酶活性。

1.5.4 金屬離子對酶活力影響的測定

金屬離子配制濃度為5 mmol/L，添加至酶活測定緩沖液中，35 ℃保溫15 min，測其脂肪酶活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶菌株的篩選

采用平板涂布法和平板劃線法從2216E 平板上分離純化到150 株深海細(xì)菌，對這些菌株產(chǎn)脂肪酶進(jìn)行了篩選，其中菌株130 產(chǎn)酶活性最高達(dá)到42 U/mL。

2.2 菌株130 的16SrRNA 基因序列和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

對菌株130 的16S rRNA 基因序列的相似性進(jìn)行比較，見圖1。

圖1 菌株130 和相關(guān)菌株序列的16S rRNA 基因序列的鄰接法系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree showing the relationships of strain 130 with the related species constructed by the neighbour-joining method and based on 16S rRNA gene sequences.(結(jié)點處數(shù)字為bootstrap 值括號內(nèi)為序列登錄號)

結(jié)果表明：菌株130 的序列與Bacillus hwajinpoensis SW-72（AF541966）的同源性為99%。從圖1 系統(tǒng)進(jìn)化樹可見，菌株130 屬于芽孢桿菌目（Bacillales），芽孢桿菌科（Bacillaceae），芽孢桿菌屬（Bacillus）。Bacillus是深海環(huán)境中常見的微生物物種，能分泌許多活性物質(zhì)，如新型低溫酶類、具有新穎結(jié)構(gòu)的先導(dǎo)化合物等[4]。關(guān)于此屬菌株能夠產(chǎn)低溫脂肪酶的研究報道較少。

2.3 部分酶學(xué)特性

溫度是影響酶促反應(yīng)的重要因素。在0 ℃～60 ℃范圍內(nèi)測定酶活力隨溫度的變化情況見圖2。

圖2 溫度對脂肪酶活性的影響Fig.2 Effect of temperature on the activity of the lipase

結(jié)果表明，該脂肪酶最適作用溫度為35 ℃，在0 ℃可保持約33%的相對酶活力。Rashid 等（2001）報道的深海適冷假單胞菌（Pseudomonas sp.）KB700A 所產(chǎn)低溫脂肪酶的最適酶活溫度也為35 ℃[5]。據(jù)Margesin 的定義[6]，通常把最適催化溫度在35 ℃左右、在0 ℃左右仍有一定催化效率的酶，稱為低溫酶。這表明該菌株分泌的胞外脂肪酶屬于低溫脂肪酶，有望應(yīng)用于低溫環(huán)境工業(yè)下的生物催化。

pH 對脂肪酶活性的影響見圖3。

圖3 pH 對脂肪酶活性的影響Fig.3 Effect of pH on the activity of the lipase

菌株130 所產(chǎn)低溫脂肪酶在pH 5～7 的范圍內(nèi)均存在著較高酶活力，最適pH 為6.0，在pH 為9.0～11.0時，幾乎沒有酶活?？梢娫撝久笧樗嵝灾久?，這與大多數(shù)低溫脂肪酶的最適pH 8.0～9.0 有顯著區(qū)別[7-8]。這種特殊的酶學(xué)特性將在工業(yè)上有廣泛應(yīng)用前景。

脂肪酶的熱穩(wěn)定性的實驗見圖4。

圖4 表明，30 ℃和40 ℃對酶活性影響不大，但隨著處理溫度的升高，熱穩(wěn)定性較差，該酶半衰期為50 ℃保溫10 min，60 ℃下保溫10 min 后酶活性下降了70 %，該酶對熱較為敏感，是長期低溫生活對環(huán)境的一種適應(yīng)，也是低溫酶的一個重要特征。

脂肪酶對金屬離子的影響情況列于表1 中。

EDTA 對脂肪酶活性沒有影響，表明該酶的催化作用不需要金屬離子的參與；某些金屬離子的存在會微弱抑制酶活，如Mg2+、Fe2+、Ca2+和K+，但Cu2+和Zn2+存在的條件下，酶活降至對照的19.20%、28.29%。

3 結(jié)論

本文從鄂霍次克海域深海微生物中篩選到產(chǎn)脂肪酶活性較高的菌株130，經(jīng)16S rRNA 分子鑒定為Bacillus sp.130。該菌株分泌的胞外脂肪酶是一種新型的低溫酸性脂肪酶，其最適作用溫度在35 ℃左右，在0 ℃可保持33%的相對酶活力，最適作用pH 6.0，相對于中溫脂肪酶最適作用溫度較低，最適作用pH 偏酸性，因此在食品、輕化工和醫(yī)藥等領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。

表1 金屬離子對脂肪酶活性的影響Table 1 Effect of metal ions on the activity of the lipase

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