周浩，李俊霞，楊紅，肖全偉，葉梅，萬渝平

（成都市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，四川成都610041）

四環(huán)素族抗生素（Tetracyclines，TCs）是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，主要包括四環(huán)素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracyline，CTC）等，由于其價格低廉，已被廣泛應(yīng)用于畜禽、水生動物和蜜蜂養(yǎng)殖中[1-2]。蜜蜂養(yǎng)殖過程中，主要用于防治蜜蜂幼蟲感染的腐臭病[3]，因而可能造成蜂產(chǎn)品中四環(huán)素類抗生素的殘留。蜂蜜是人們非常喜歡的一類食品，長期食用受四環(huán)素類抗生素殘留的蜂蜜會嚴(yán)重危及人類的身體健康，四環(huán)素類藥物的毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)在對胃、腸、肝、腎的損害以及對牙齒和骨骼的破壞，最顯著的殘留毒性是誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生[3-4]。目前四環(huán)素類抗生素的檢測方法有微生物法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法和質(zhì)譜連用法[3]等，雖然這些方法都準(zhǔn)確可靠，但前處理繁瑣復(fù)雜，檢測時間較長，遠不能滿足大批量樣品快速檢測的需要；因此需要準(zhǔn)確快速的方法來篩檢蜂蜜中四環(huán)素族抗生素殘留，從而縮短陰性樣品的檢測時間，旨在建立了一種快速、準(zhǔn)確、可靠的放射免疫法用于蜂蜜中四環(huán)素類抗生素的日常檢測。

1 材料與方法

1.1 設(shè)備與材料

1.1.1 儀器和設(shè)備

Charm II 7600 分析儀、電熱恒溫器（THERMO M3760-33）、渦旋振蕩器（INCTRONTC.2）專用硼硅玻璃試管及試管塞：美國CharmⅡ公司產(chǎn)品；離心機（GEMANY ROTOFIX 32A），精密pH 試紙（5.0～10.0），微量移液器等。

1.1.2 試劑

四環(huán)素類抗生素檢測試劑盒及閃爍液，提取緩沖溶液（Extraction Buffer），多抗標(biāo)準(zhǔn)品，調(diào)節(jié)pH 緩沖液、陰性組織提取物，以上試劑均由Charm 公司試劑盒提供。

1.1.3 四環(huán)素類標(biāo)準(zhǔn)品

四環(huán)素、土霉素、金霉素，氯霉素、恩諾沙星、新霉素、慶大霉素、鏈霉素、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、紅霉素、青霉素G 等標(biāo)準(zhǔn)品：Sigma 公司。

1.1.4 試驗樣品

市場購買蜂蜜20 組，四環(huán)素類抗生素陽性留檢樣品10 組及陰性樣品40 組。

1.2 方法

1.2.1 測試原理

放射免疫法原理基于兩個方面，其一：每類抗生素族均是在一個母環(huán)基礎(chǔ)上用不同的功能團修飾形成特定功效的抗生素。其二，微生物細(xì)胞表面都存在著能與抗生素功能基團結(jié)合的特異受點[5]。Charm II 放射免疫分析法測定使用兩種試劑：一種是被[3H]標(biāo)記的四環(huán)素，另一種是四環(huán)素抗生素結(jié)合試劑（微生物細(xì)胞上的特異性受體）。當(dāng)樣品中含有四環(huán)素類抗生素殘留時，殘留物與結(jié)合試劑受體上的結(jié)合位點結(jié)合，從而阻止了[3H]標(biāo)記的四環(huán)素與結(jié)合位點的結(jié)合。[3H]標(biāo)記的四環(huán)素結(jié)合越多，則樣品中四環(huán)素類抗生素殘留越少。用液體閃爍計數(shù)儀測定樣品中的[3H]的cpm （count per minute 每分鐘脈沖數(shù)）值，cpm 值越大，樣品中的四環(huán)素類抗生素殘留量越低[5-7]。

1.2.2 樣品制備

稱取1 g 蜂蜜于做好標(biāo)記的帶蓋樣品管，加10 mL提取緩沖液至樣品管中，旋渦振蕩15 s。如果蜂蜜有結(jié)晶，可置于不超過60 ℃的水浴中溫?zé)幔袷?，待樣品全部溶解后，迅速冷卻至室溫。用pH 試紙測試pH，滴加調(diào)節(jié)pH 緩沖液緩沖液，直到將pH 調(diào)至7.5，此液為待測液。

1.2.3 測定步驟

取出檢測試劑盒，用壓桿將白色藥片（微生物受體）推出到空的試管中；用加液器取300 μL 溫水至管中，用旋渦振蕩混合10 s 將藥片打碎；用移液器加5 mL 樣品，接著將橙色藥片（[3H]標(biāo)記的四環(huán)素抗體）推至試管中；用混合器混合15 s；在36 ℃的孵育器孵育5 min；將離心機調(diào)至4 000 r/min 離心5 min；立即小心棄去上清液，用吸水物將測試管邊緣的水珠擦干；加300 μL 溫水，用旋渦振蕩混合10 s 將沉淀物打碎；加3 mL 閃爍液至試管中，加蓋，混勻，靜置1 min。在Charm II 7600 分析儀的[3H]頻道進行60 s 計數(shù)，將測得結(jié)果與控制點比較，如果樣品cpm 值大于控制點，則判定為陰性；如果樣品cpm 值小于或等于控制點，應(yīng)判定為初篩陽性。

1.2.4 控制點的確定

按照GB14963-2003《蜂蜜衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的要求，蜂蜜中四環(huán)素族抗生素殘留量應(yīng)不大于50 μg/kg，因此應(yīng)選陰性樣品加標(biāo)濃度為50 μg/kg 作為控制點。首先用LC-MS 方法確定6 組蜂蜜中四環(huán)素類殘留陰性樣品，在6 份陰性樣品中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品，形成樣品中四環(huán)素類含量50 μg/kg，按照1.2.2 中進行提取，1.2.3 的步驟進行測定，得出6 個cpm 值，計算其平均值?？紤]提取過程中的回收以及防止假陰性出現(xiàn)，因此控制點的cpm 值確定在平均值的基礎(chǔ)上上調(diào)10%，即控制點cpm 值＝平均值×（1＋10%）。

1.2.5 陽性結(jié)果的確定

當(dāng)樣品cpm 值小于控制點cpm 值時，應(yīng)首先同時測定一個陰性質(zhì)控和一個陽性質(zhì)控，以確定試劑和設(shè)備是否工作正常，測試的陽性質(zhì)控應(yīng)該小于控制點。再重新取樣平行測定，如果重測樣品的cpm 小于控制點，且試劑和設(shè)備正常，則判定樣品初篩陽性，改用LC-MS 法進行確定。

1.2.6 交叉反應(yīng)

分別將氯霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、青霉素G、阿莫西林、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、紅霉素、螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，添加到陰性樣品中，配成含單一抗生素以及多種抗生素濃度為1 000 μg/kg 的蜂蜜樣品，樣品處理及檢測方法同1.2.2 和1.2.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將金霉素標(biāo)準(zhǔn)品添加入四環(huán)素陰性蜂蜜樣品中，使添加后蜂蜜中金霉素的濃度分別為20、50、80、100、150、200、250、300、350、400 μg/kg，按1.2.3 節(jié)測定步驟檢測其cpm 值，結(jié)果見圖1。

圖1 金霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of CTC

由于在Charm II 放射免疫分析中作為受體的細(xì)菌和被[3H]標(biāo)記的抗原的量是固定的，因此當(dāng)樣品中競爭性抗原濃度增加時其競爭效率下降，表現(xiàn)在圖上就是曲線趨于平緩。

2.2 加標(biāo)試驗

用50 μg/kg 篩選水平，陰性樣品分別添加四環(huán)素，土霉素，金霉素以及它們混合標(biāo)準(zhǔn)，混標(biāo)1：（土∶四∶金=4∶3∶3），混標(biāo)2：（四∶土∶金=4∶3∶3），混標(biāo)3：（金∶土∶四=4∶3∶3），結(jié)果見表1。

從表1 可以看出，無論是單標(biāo)還是混標(biāo)，在50 μg/kg篩選水平實驗中篩選結(jié)果均為陽性。

2.3 比對試驗

在對用LC-MS 法檢測結(jié)束的50 組留檢樣品，其中四環(huán)素類抗生素（總量大于50 μg/kg）陽性留檢樣品10 組及陰性樣品40 組，用charm II 放射免疫法檢測，結(jié)果見下表2。

表2 放射免疫法與LC-MS 法對50 組樣品檢測結(jié)果Table 2 The radioimmunoassay and LC-MS method deter mination result of 50 group samples

2.4 應(yīng)用檢測

以50 μg/kg 作為篩選水平，對20 組市場購買的蜂蜜進行篩選，其結(jié)果見表3。

表3 蜂蜜中四環(huán)素類抗生素殘留測定Table 3 Determination of tetracycline antibiotics residues in Honey

用LC-MS 方法驗證4、8、17 號樣品的四環(huán)素類殘留總量結(jié)果分別為121.3、60.6、184.1 μg/kg。同時驗證其余陰性樣品，測定結(jié)果均小于50 μg/kg。表明應(yīng)用情況良好，篩選結(jié)果可靠。

2.5 交叉反應(yīng)

對1.2.6 中其它族抗生素的反復(fù)加標(biāo)試驗，與控制點比較cpm 值，結(jié)果均為陰性。表明charm II 放射免疫分析法特異性強，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，與本族以外的抗生素?zé)o交叉反應(yīng)。

3 小結(jié)

目前在日常檢測中陽性樣品相對于陰性樣品很少，因此檢測發(fā)展的趨勢之一就是快速區(qū)分陽性與陰性樣品。Charm II 放射免疫分析法是結(jié)合微生物學(xué)與免疫學(xué)各自特點發(fā)展起來的，該方法已經(jīng)被美國FDA認(rèn)可；主要應(yīng)用于食品抗生素殘留的初篩[7]。放射免疫檢測法最突出的優(yōu)點是操作簡單、速度快、分析成本低，特別適用于大量樣品的篩選，從接收樣品到出結(jié)果，整個過程大約20 min。一個陰性結(jié)果不但表明該樣品中含四環(huán)素族單種抗生素濃度分別小于50 μg/kg，同時也可表示為四環(huán)素族濃度總和不超過50 μg/kg。所以，Charm II 放射免疫法檢測，提供了一種很好的蜂蜜中多種四環(huán)素類抗生素檢測的快速篩選方法。

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