張秀麗，楊小明，何娟，馬海樂，田婷，孫樂六

（1.鹽城工學(xué)院博雅學(xué)院,江蘇鹽城224051；2.江蘇省生物資源加工與分離技術(shù)工程中心，江蘇鎮(zhèn)江212013；3.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

無花果（Ficus carica L.）又名“映日果”、“奶漿果”，其果實口味香甜，日常作為鮮果、果脯和果汁食用。中醫(yī)認為無花果味甘、性涼，具有清肺熱、止胃痛、通乳、潤腸、消腫解毒等功效。無花果含有豐富的維生素、微量元素，是一種具有豐富營養(yǎng)和藥用價值的水果。無花果的抗腫瘤作用已有廣泛的研究，其抗腫瘤活性成分主要為苯甲醛、補骨脂素、香檸檬內(nèi)酯等[1-2]，此外戴偉娟等[3-5]報道無花果多糖（Ficus carica polysaccharides,FCPS）具有免疫活性，是一種免疫功能調(diào)節(jié)劑。王振斌等[6-8]對無花果多糖的提取條件進行了優(yōu)化。吳亞林[9]對無花果粗多糖進行純化后得到兩個單一多糖，進行了紅外、紫外光譜分析。但目前尚未見有關(guān)無花果多糖分子量分布、單糖組成的報道。作者在王振斌無花果多糖提取技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，重點考察了無花果多糖分離純化中乙醇用量和脫蛋白方法對得率的影響，完善了無花果多糖的分離純化工藝，得到精制無花果多糖，并對其理化性質(zhì)、含量、分子量范圍和單糖組成進行了研究，為無花果多糖的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無花果渣（榨取無花果汁后的殘渣）：江蘇豐縣中研無花果責(zé)任有限公司提供；濃硫酸：上海國藥提供；考馬斯亮藍、標(biāo)準分子量葡聚糖（Dextran 系列）：購自Sigma 公司；L-鼠李糖：北京化學(xué)試劑公司。

D-木糖：上海國藥；D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖：上海試劑二廠；D-阿拉伯糖Sigma 公司；無水Na2CO3、無水乙醇、碘、碘化鉀、茚三酮、α-萘酚等：購自上?；瘜W(xué)試劑公司。以上試劑皆為分析純，試驗用水為二次蒸餾水。

HH 恒溫水浴鍋：江蘇中大儀器廠；GFB 高速萬能粉碎機：北京長風(fēng)儀器儀表廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；AvantiJ25 冷凍離心機：貝克曼公司；Pellicon 小型超濾系統(tǒng)：美國Millipore 公司；ALPHA2 -4 冷 凍 干 燥 機： 德 國 CHRIST 公 司；CARY100Conc 紫外可見分光系統(tǒng)，高效液相系統(tǒng)、ProStar210 泵、ProStar 355 RI 檢測器：美國VARIAN 公司；日本TSK-GEL G4000PW（7.5×300 cm）凝膠柱、DZF-6020 型真空干燥器：上海益恒實驗儀器有限公司；NEXUS670 傅立葉紅外分光光度計：Nicolet 公司；氣相色譜HP5890、色譜柱HP-INNOWAX 19091N-133：美國HP 公司。

1.2 方法

1.2.1 無花果多糖的分離

1.2.1.1 提取

按王振斌[6]方法提取。50 g 干燥無花果渣粉（20 目篩網(wǎng)粉碎）加入500 mL 石油醚（沸程60 ℃～90 ℃）脫脂三次，待溶劑揮發(fā)后加入12 倍量蒸餾水，100 ℃，180 min 提取兩次，過濾，合并濾液。

1.2.1.2 Sevag 法脫除蛋白

濾液濃縮至原體積的1/4 后，加入Sevag 試劑（提取液∶氯仿∶正丁醇=25 ∶4 ∶1），振搖均勻后靜置分層，除去水相與有機相交界處的灰白色變性蛋白質(zhì)，水相繼續(xù)加入Sevag 試劑，重復(fù)多次。取水相分別測定蛋白和多糖含量，計算蛋白脫除率和多糖保留率。

1.2.1.3 乙醇沉淀

脫蛋白后的提取液在攪拌下慢慢加入一定體積的無水乙醇，使乙醇終濃度分別為30%、45%、60%、75%和90%（體積比），于4℃靜置12 h，離心（3000 r/min,20 min）分離，收集沉淀，即得無花果粗多糖，計算得率?？疾煲掖加昧繉Υ侄嗵堑寐实挠绊?。

1.2.2 無花果多糖的精制

無花果粗多糖加水溶解，用截留分子量為10KD的平面纖維素超濾膜超濾（ΔP=0.1 MPa,T=25 ℃），收集分子量大于10 KDa 部分，在60 ℃以下濃縮至原體積的1/4，攪拌下慢慢加入無水乙醇至75%濃度，4 ℃靜置12 h，離心（3 000 r/min,20 min）分離，沉淀以無水乙醇、丙酮洗滌，冷凍干燥，得精制無花果多糖。計算得率。

1.2.3 無花果多糖及蛋白含量的測定

總糖含量測定采用苯酚-硫酸法[10]，以葡萄糖為標(biāo)準單糖，苯酚-硫酸顯色后，測定A490 nm，得標(biāo)準曲線為A=0.808C－0.012，R=0.9991。

蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[8]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準蛋白，考馬斯亮藍G250 顯色后，測定A595 nm，得標(biāo)準曲線為A=5.779 9C＋0.010 2，R =0.999 4。式中：A 為吸光度；C 為糖/蛋白濃度，（mg/mL）。

1.2.4 無花果多糖的化學(xué)性質(zhì)驗證

1.2.4.1 外觀及溶解性

觀察精制無花果多糖的形狀、顏色，并將其溶于水、乙醇、丙酮和乙醚，觀察其溶解性。

1.2.4.2 碘-碘化鉀反應(yīng)

取1%無花果多糖1 mL，加入碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化。

1.2.4.3 Molish 試劑反應(yīng)

取1%無花果無花果多糖1 mL 加入試管，滴家α-萘酚試劑，混勻后，傾斜試管，沿管壁慢慢加入濃硫酸1 mL，豎直試管觀察濃硫酸與糖交界面顏色變化。

1.2.4.4 茚三酮反應(yīng)

取1%無花果多糖1 mL，加入0.5 mL 0.1%茚三酮乙醇溶液，混勻煮沸2 min，冷卻后觀察顏色變化。

1.2.4.5 紫外光譜檢測

將1 %的FCPS 稀釋一定倍數(shù)后，在190 nm～400 nm 范圍掃描。

1.2.4.6 紅外光譜檢測

取5 mg FCPS 凍干樣品，KBr 壓片后，在400 cm-1～40 000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.2.4.7 分子量范圍測定

將Dextran T-10、T-40、T-70 、T-500、T-2000 以水溶解后，進樣于高效液相色譜（柱溫30 ℃，檢測器35 ℃，流動相為娃哈哈純凈水，流速0.5 mL/min），精制無花果多糖用0.2 M NaCl 溶液配成0.5%的濃度，在相同條件下分析，推算無花果多糖的相對分子量。

1.2.5 無花果多糖單糖組成分析

1.2.5.1 樣品處理

準確稱取精制無花果多糖10.8 mg，加入3 mL 2 mol/L 三氟乙酸,封口后于100 ℃水解8 h,水解液于40 ℃～50 ℃真空蒸干，加入10.9 mg 鹽酸羥胺、6.8 mg內(nèi)標(biāo)，0.5 mL 吡啶，封口后于90 ℃水浴30 min，冷卻后再加入0.5 mL 乙酸酐90 ℃水浴30 min，取1.0 μL 進樣進行GC 分析。

1.2.5.2 標(biāo)準單糖處理

準確稱取鼠李糖（Rha）9.5 mg, 阿拉伯糖（Ara）9.5 mg，木糖(Xyl)11.5 mg，半乳糖（Gal）9.7 mg，甘露糖（Man）10.0 mg，葡萄糖（Glu）10.6 mg，內(nèi)標(biāo)8.2 mg，加入鹽酸羥胺60.9 mg, 吡啶3 mL，封口后90 ℃水浴30 min，冷卻后再加入乙酸酐3 mL 同樣處理。

1.2.5.3 GC 分析條件

爐溫210 ℃，進樣口250 ℃，F(xiàn)ID 檢測器溫度250 ℃；載氣為氮氣；載氣流速0.82 mmL/min，總流量為34 mL/min；分流比40 ∶1。

由對照單糖標(biāo)準品保留時間確定單糖種類，根據(jù)各標(biāo)準單糖質(zhì)量和峰面積計算換算因子，推算出無花果多糖中各單糖相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 無花果多糖提取液中蛋白的脫除

Sevag 法脫蛋白效果見圖1。

圖1 Sevag 法脫蛋白的效果及對多糖得率的影響Fig.1 The effects of Sevag method on protein eliminated rate and polysaccharides retainment

隨著脫除次數(shù)的增加，蛋白脫除率逐漸上升，但多糖保留率卻逐漸下降。蛋白的脫除是以損失多糖為代價，因此本試驗中選擇脫蛋白6 次。

2.2 乙醇加入量對多糖得率的影響

乙醇加入量對多糖得率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數(shù)對無花果多糖得率的影響Fig.2 The effects of ethnol volume fraction on polysaccharides yield rate

試驗結(jié)果表明，多糖得率隨著乙醇濃度的上升有明顯的增加趨勢，到75%以上明顯緩慢。這與多糖分子量大小有關(guān)，大分子量多糖溶解性較差，在低濃度的乙醇中既可沉淀，而小分子多糖則要較高濃度下才能沉淀，部分單糖與寡糖不會沉淀。在試驗中，選擇75%的乙醇體積分數(shù)進行無花果多糖的沉淀。

由上述試驗結(jié)果，無花果多糖分離純化的工藝流程為：

2.3 無花果多糖表觀性狀

經(jīng)過脫蛋白、脫除小分子雜質(zhì)后的無花果多糖為淺灰色疏松狀粉末，無味，易溶于水，其水溶液pH4.2，難溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。

碘-碘化鉀試驗為陰性，Molish 反應(yīng)為陽性，茚三酮反應(yīng)為陰性。

2.4 無花果多糖得率及總糖含量

精制無花果多糖的得率4.1%，按苯酚-硫酸法測得總糖含量為91%。

2.5 紫外檢測

紫外掃描圖譜如圖3 顯示。

無花果多糖在192 nm 有明顯的吸收峰，表現(xiàn)為糖的特征吸收，260 nm、280 nm 處沒有蛋白質(zhì)、核酸的特征吸收。

2.6 紅外光譜

圖4 顯示無花果多糖具有典型的多糖特征吸收峰（3 378、2 938、1 743、1 618、1 421 cm-1）。表現(xiàn)為378 cm-1處的O-H 伸縮振動，2 938、1 421 cm-1的C-H伸縮振動與變角振動；1 250～950 cm-1之間存在的吸收峰，提示糖鏈構(gòu)型為吡喃型。

2.7 分子量測定

標(biāo)準分子量葡聚糖與保留時間的回歸方程為:Log Wt=9.618 8-0.324 6 Tr，R=0.994 7. 無花果多糖的分子量分布范圍在5.92×105～1.95×106之間。

2.8 單糖組成分析

無花果多糖水解液的GC 譜圖見圖5。

其中圖5A 為單糖標(biāo)準品，按出峰時間先后順序分別為Rha、Ara、Xyl、Man、Glu、Gal 和內(nèi)標(biāo)。測定結(jié)果表明，水解液出峰的保留時分別與Rha、Ara、Xyl、Man、Glu 和Gal 準確對應(yīng)，說明無花果多糖中含有這6 種單糖，其摩爾質(zhì)量比值為1.93 ∶3.86 ∶0.46 ∶0.55 ∶7.42 ∶2.87。

3 結(jié)論

（1）三氯乙酸法脫蛋白常會引起多糖的降解，且制備的多糖復(fù)溶性差。故本試驗采用Sevag 法，避免了多糖的降解，制備的多糖復(fù)溶性好。采用Sevag 法脫蛋白6 次，多糖保有率為70.2%。

（2）無花果多糖為淺灰色粉末，化學(xué)性質(zhì)驗證為非淀粉多糖，紫外掃描說明不含蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸，得率為4.1%，總糖含量為91%。

（3）本試驗采用高效凝膠色譜測定出無花果多糖的分子量分布范圍在5.92×105～1.95×106之間。

（4）采用GC 法對無花果多糖進行了單糖鑒定，是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其摩爾質(zhì)量比值為1.93 ∶3.86 ∶0.46 ∶0.55 ∶7.42 ∶2.87。

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