王春霞，田莉，田樹革，吳玲玲

（1.蘭州軍區(qū)烏魯木齊藥品器材供應站，新疆烏魯木齊830002；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學重點實驗室，新疆烏魯木齊830011；3.新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院，新疆烏魯木齊830011）

小 豆 蔻 （Elettaria cardamomum） 是 姜 科（Zingiberaceae）植物小豆蔻（Elettaria cardamomum（L.）Maton）的干燥成熟果實，是新疆維吾爾醫(yī)常用藥材，在《維吾爾醫(yī)常用藥材》（維吾爾文）中記載小豆蔻的維吾爾語名稱為Kqiklaqindane（克其克拉秦達乃）[1]。小豆蔻主產(chǎn)于斯里蘭卡、印尼、印度南部海岸，夏、秋季果實成熟時采收，晾干，我國不出產(chǎn)，主要由巴基斯坦和印度進口新疆。小豆蔻氣芳香而濃烈，味辣、微苦，含3%～8%的揮發(fā)油，油中含松油醇-4α-松油醇、乙酸松油醇酯、桉油精等，是一種常見調(diào)料[2]。小豆蔻收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部標準》（維吾爾藥分冊），認為其二級干熱，具有健胃助食，止瀉止嘔，爽神悅志的功能，維醫(yī)臨床用于治療腹痛胃脹，食少噯氣，嘔惡口臭，腹瀉反胃，口舌生瘡，偏頭痛等癥[3]。

在維吾爾民間多有使用小豆蔻治療腹瀉反胃、口舌生瘡，但對其抑菌研究的相關報道少見。本文采用微孔板法、連續(xù)稀釋法和吸收度法進行了其體外抑菌實驗的初步研究。

1 材料和儀器

1.1 材料

小豆蔻，2010年9月購于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)新疆醫(yī)科大學中醫(yī)學院烏莉婭·沙衣提教授鑒定為姜科植物小豆蔻（Elettaria cardamomum（L.）Maton）的干燥成熟果實。

1.2 供試菌種和試劑

大腸桿菌（Escherichia coli，ATCC 35218）、變異鏈球菌（streptococcus mutans，ATCC 700610）：均購自中國藥品生物制品檢定所。

腦心浸液培養(yǎng)基（Brain Heart Infusion Broth，BHI）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（Nutrient Broth，NB）：均購自美國BD 公司；結(jié)晶紫：上海研晶生物科技有限公司；去氧膽酸鈉（Sodium deoxycholate，SD，Sigma-Aldrich 公司）；其余試劑均為分析純。實驗用水為蒸餾水。

1.3 主要儀器

SPECTRAMAX 190 酶標儀：美國Molecu1ar Devices 公司；YJ-875A 醫(yī)用凈化工作臺：蘇州金燕凈化設備廠；DNP-9162 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；3110 系列CO2培養(yǎng)箱：美國賽默飛世爾科技公司；YXQ-LS-SI 全自動立式電熱壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業(yè)醫(yī)療設備廠；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

2 方法

2.1 小豆蔻提取物的制備

精確稱取干燥小豆蔻粗粉200 g，用石油醚1.5 L回流提取1.5 h 后，濾過，濾渣依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇和水1.5 L 回流提取2 h 后濾過，均重復提取3 次，濾液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮減壓后得稠浸膏，再經(jīng)冷凍干燥制成粉末，密封冷藏保存。

2.2 抑菌試驗

2.2.1 菌種復蘇與培養(yǎng)

將變異鏈球菌、大腸桿菌標準菌種分別置于裝有2 mL BHI 培養(yǎng)基、NB 培養(yǎng)基的有蓋試管中，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)16 h 后，經(jīng)比濁法判斷試管變渾濁，說明菌種已復蘇。

把滅過菌的培養(yǎng)皿和培養(yǎng)基倒平板，冷卻凝固后，用接種針挑取少許待復蘇后的標準菌種進行劃線接種，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，再進行活化，使這些菌種有較強的活力[4]。

經(jīng)復蘇轉(zhuǎn)種培養(yǎng)后，分別取新傳代變異鏈球菌、大腸桿菌置于已滅菌的裝有2 mL 培養(yǎng)基的有蓋試管中，加入適量40%葡萄糖，置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，培養(yǎng)液用肉湯培養(yǎng)基稀釋，充分震蕩后并用經(jīng)麥氏比濁管法調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL。

2.2.2 微孔板法篩選抑菌活性

采用96 孔微孔板進行抑菌活性的快速篩選[5]。分別取變異鏈球菌、大腸桿菌懸液用培養(yǎng)液50 倍稀釋，混勻。把維藥材小豆蔻的不同極性提取物溶解在適宜溶劑中制成2 mg/mL 的溶液，經(jīng)微孔濾膜除菌后，在96 孔板上分別用肉湯培養(yǎng)基與大腸桿菌、變異鏈球菌作連續(xù)對倍稀釋，使含藥濃度分別為1 000、500、250、125、62.5 μg/mL。相同條件下，以純二甲基亞砜作溶劑對照，僅含菌液做空白對照，以阿莫西林作為陽性對照，同一板重復4 次，共置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h，以培養(yǎng)液透明為無菌生長的最低抑菌濃度（MIC 值）。

2.2.3 抑菌效果的測定

用酶標儀于450 nm 波長處測定細菌的OD（Optical Density）值，將96 孔板用蒸餾水清洗數(shù)遍，再用1%結(jié)晶紫染色15 min，用蒸餾水沖洗至透明后，加入2%的SD 洗脫生物膜，再用酶標儀于605 nm 波長處測試生物膜的OD 值。抑菌率的計算方法如下：

3 結(jié)果與分析

3.1 小豆蔻不同極性提取物對變異鏈球菌的抑菌率

采用微孔板對倍稀釋法測定小豆蔻不同極性的5種提取物對變異鏈球菌生長及其生物膜形成的抑制率，結(jié)果如表1，表2。

由表1，表2 可知，小豆蔻的氯仿、乙酸乙酯提取物在低于250 μg/mL 時對變異鏈球菌的生長有部分的抑制作用；正丁醇、乙醇提取物對變異鏈球菌的生長及其生物膜形成有不同程度的抑制作用；水提取物對變異鏈球菌的生長無抑制作用，但對其生物膜的形成有部分的抑制作用，當濃度為1 mg/mL 時，抑制率為58.74%。

表1 小豆蔻不同極性提取物對變異鏈球菌生長的抑制率（n=4）Table 1 The different extract fractions of Elettaria cardamomum inhibit the growth rate of Streptococcus mutans inhibition（Mean±SD，n=4）

表2 小豆蔻不同極性提取物對變異鏈球菌生物膜形成的抑制率（n=4）Table 2 The different extract fractions of Elettaria cardamomum inhibit biofilm formation of Streptococcus mutans inhibition（Mean±SD，n=4）

3.2 小豆蔻不同極性提取物對大腸桿菌的抑菌率

采用微孔板對倍稀釋法測定小豆蔻不同極性的5種提取物對大腸桿菌生長及其生物膜形成的抑制率，結(jié)果如表3，表4。

由表3、表4 可知，5 種不同極性的提取物對大腸桿菌生長均無抑制作用，但對大腸桿菌生物膜形成均有不同程度的抑制作用，其中，氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物抑制大腸桿菌生物膜形成的作用很強，氯仿提取物在1 000 μg/mL～62.5 μg/mL 濃度范圍，抑制率均大于90%，其次為乙酸乙酯，濃度為62.5 μg/mL 時抑制率為68.54%，正丁醇提取物濃度為125 μg/mL 時的抑制率為49.54%。

表3 小豆蔻不同極性提取物對大腸桿菌生長的抑制率（n=4）Table 3 The different extract fractions of Elettaria cardamomum inhibit the growth rate of Escherichia coli inhibition（Mean±SD，n=4）

表4 小豆蔻不同極性提取物對大腸桿菌生物膜形成的抑制率（n=4）Table 4 The different extract fractions of Elettaria cardamomum inhibit biofilm formation of Escherichia coli inhibition（Mean±SD，n=4）

3.3 不同提取物對受試菌的MIC50

依據(jù)MIC50的判斷標準，小豆蔻水提取物抑制變異鏈球菌生物膜形成的MIC50為1 mg/mL；氯仿、乙酸乙酯提取物抑制大腸桿菌生物膜形成的MIC50均小于62.5 μg/mL，正丁醇提取物的MIC50為125 μg/mL，水提取物的MIC50為1 mg/mL。

結(jié)果表明，小豆蔻正丁醇、乙醇和水提取物對變異鏈球菌的生物膜形成有一定抑制作用；氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取物中含有能有效抑制大腸桿菌生物膜形成的活性成分。

4 討論

細菌生物膜（Biofilm）是細菌的一種保護性生長模式，是細菌被包裹在自身分泌的多聚物中形成具高度分化結(jié)構(gòu)的特殊細胞群體結(jié)構(gòu)，能不斷地釋放浮游細菌引起持續(xù)性感染，對抗生素和宿主免疫防御機制的抗性很強，80%的細菌性感染與其有關[6-7]，主要有由革蘭陽性球菌導致的齲齒，革蘭陰性厭氧性口腔細菌導致的牙菌斑，腸道細菌引起的膽囊感染，以及大腸桿菌和其他革蘭陰性菌引起細菌性前列腺炎等[8]，從天然產(chǎn)物中篩選抑制細菌生物膜形成的活性成分已成為藥物的研發(fā)熱點。

經(jīng)化學鑒別預試驗檢出小豆蔻中含生物堿，糖和苷類，有機酸，氨基酸，蛋白質(zhì)、酚類鞣質(zhì)和油脂類等成分。抑菌篩選時發(fā)現(xiàn)，小豆蔻提取物對大腸桿菌沒有抑菌作用，反而有促進細菌生長的的趨勢，可能其所含糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸等成分為細菌生長提供了營養(yǎng)成分。小豆蔻不同極性提取物所含化學成分的類別和含量不同，使其抑菌活性不同，而同一提取物對不同菌種的抑制敏感性也存在差異。本方法可為小豆蔻的藥用開發(fā)提供實驗依據(jù)，對小豆蔻抑菌成分、機理及對其他細菌的影響還有待進一步研究。

[1] 黃輝,張彥福.維吾爾藥小豆蔻名實考辯[J].中國民族民間醫(yī)藥雜志,1998(6):29-32

[2] 馬新玉,潘葦芩.小豆蔻的顯微鑒別研究[J].新疆中醫(yī)藥,2005,23(2):48

[3] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準(維吾爾藥分冊)[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社,1999

[4] 李悅,侯濱濱,靜寶元.葡萄柚精油抑菌活性的研究[J].食品研究與開發(fā),2010,31(11):237-240

[5] Ramage G,Vande-Walle K,Wickes B L,et al．Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilm[J].Antimicrob Agents Chemother,2001,45(9):2475-2479

[6] Vilchez R,Lemme A,Thiel V et al.Analysing traces of autoinducer-2 requires standardization of the Vibrio harveyi bioassay[J].Anal Bioanal Chem,2007,387(2):489-96

[7] 屈常林,高洪,趙寶洪,等.細菌生物被膜與抗生素耐藥機制研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2008,29(3):86-90

[8] Stewat P S,Costerton J W.Antiblotic resistance of bacteria in bioilms[J].Lancet,2001,358(9276):135-138