吳憶春

（山東濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州256603）

黃河三角洲地區(qū)PRRSV的分離鑒定及ORF4、ORF5基因遺傳特性分析

吳憶春

（山東濱州職業(yè)學(xué)院生物工程學(xué)院，山東濱州256603）

采集黃河三角洲地區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生高熱癥死亡的仔豬病料，處理后接種Marc－145細(xì)胞，傳代2代以后出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，其病毒TCID50為10－4．625／m L，采用PCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)物中偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒，均為陰性。采用第2代細(xì)胞培養(yǎng)物人工感染仔豬，仔豬出現(xiàn)高熱、咳嗽、發(fā)紺、耳朵發(fā)紫、死亡等臨床表現(xiàn)，剖檢發(fā)病豬可見明顯的間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，采集肺、脾、腎和淋巴結(jié)等組織進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，均能檢測(cè)到PRRSV，初步認(rèn)為分離到一株高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒，命名為HSJ－1102株。對(duì)該分離株ORF4、ORF5基因進(jìn)行擴(kuò)增與克隆測(cè)序，序列分析表明，該分離株ORF4基因序列與JXA1、Ch1－a等毒株的同源性較高，在97．4%～99．3%之間，與VR2332等毒株同源性低于90%；分離株ORF5基因序列與JXA1等毒株同源性為97%～99．8%，與Ch1－a，VR2332等毒株同源性較低，分別為92．5%和86．4%。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；分離鑒定；ORF4；ORF5

自1989年首次報(bào)道豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）病例以來，PRRS已經(jīng)成為影響?zhàn)B豬業(yè)的重慶疫病，在全世界范圍內(nèi)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［1］。目前，現(xiàn)有疫苗尚不能完全有效地控制所有或大部分豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）流行毒株，這與病毒的高變異性、病毒對(duì)宿主先天免疫反應(yīng)的潛在影響、豬個(gè)體免疫反應(yīng)的差異性等多方面因素有關(guān)。20多年來，人們對(duì)PRRSV的感染方式、致病機(jī)制與免疫預(yù)防進(jìn)行了不懈的研究，但由于PRRSV的高變異性等原因，研究過程中仍然存在著大量的難題［2－3］。本試驗(yàn)從黃河三角洲地區(qū)某豬場(chǎng)發(fā)生高熱癥死亡的仔豬采集病料，進(jìn)行了PRRSV的分離鑒定及ORF4、ORF5基因的克隆與序列分析，為開展PRRSV遺傳變異研究提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 病料 2011年1月采自黃三角區(qū)某規(guī)模豬場(chǎng)患高熱癥仔豬的新鮮淋巴結(jié)、肝、肺、脾等組織樣品。

1．1．2 試劑 Trizol試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品；AMV、RNase－inhibitor、rTaq酶、d NTPs、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基等細(xì)胞培養(yǎng)試劑為北京清大天一有限公司產(chǎn)品。

1．1．3 細(xì)胞 Marc－145細(xì)胞由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院惠贈(zèng)。

1．2 方法

1．2．1 病料處理 疑似PRRSV病豬組織，經(jīng)剪碎、研磨，加入DMEM培養(yǎng)液配成1∶5的病料懸液，在－20℃反復(fù)凍融3次后，4 000 r／min離心10 min，取上清液，經(jīng)0．22μm濾器濾過除菌后加入青霉素﹑鏈霉素（1 000 U／m L），4℃過夜后置－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2．2 病毒分離培養(yǎng) 將已經(jīng)處理后的病料組織濾液接種于生長(zhǎng)良好的Marc－145細(xì)胞單層，37℃吸附1 h，添加9 m L的細(xì)胞維持液（含20 m L／L小牛血清）后，在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 d～7 d，逐日觀察記錄細(xì)胞病變（CPE）。無(wú)病變繼續(xù)傳代，有病變的細(xì)胞液凍融3次后于－20℃存放備用。

1．2．3 病毒TCID50的測(cè)定 將第2代分離毒按照10－1、10－2、…10－6進(jìn)行稀釋后，分別接種于長(zhǎng)滿Marc－145細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度重復(fù)8個(gè)孔，每孔接種100μL病毒液，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。將培養(yǎng)板置于37℃、在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d～7 d，觀察細(xì)胞病變，按Reed－Muench法計(jì)算病毒的TCID50。

1．2．4 分離株的 RT－PCR檢測(cè)

1．2．4．1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank登錄的HB0706（FJ800681）株設(shè)計(jì)擴(kuò)增分離株Nsp2部分序列的特異性引物，序列如下：上游引物F1：5′TTCAACCTCGAAGAACAAAGTC 3′；下游引物 F2：5′GCATGTCAACCCTATCCCAC 3′。擴(kuò)增區(qū)間為2 671 bp～3 354 bp，目的片段預(yù)期大小為678 bp。

1．2．4．2 分離株總RNA的提取 采用RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取。

1．2．4．3 反轉(zhuǎn)錄體系（cDNA 的合成） 反轉(zhuǎn)錄酶0．5μL，5×buffer 4μL，d NTP 2μL，下游引物1 μL，模板3μL，DEPC處理超純水9．5μL。42℃反應(yīng)1 h，70℃10 min。

1．2．4．4 PCR反應(yīng)體系 cDNA 模板2μL，上下游引物各0．5μL，PCR buffer 2．5μL，d NTP 2μL，r Tag酶0．5μL，加水至25μL。反應(yīng)參數(shù)為：94℃5 min；94℃45 s，56℃45 s，72℃60 s，32個(gè)循環(huán)；72℃10 min，4℃結(jié)束反應(yīng)。結(jié)束后將PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1．2．5 外源病毒排除試驗(yàn) 參考GenBank登錄的基因序列合成3對(duì)引物，采用PCR或RT－PCR檢測(cè)豬偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒。

1．2．6 人工感染試驗(yàn) 選取4周齡～5周齡PRRSV抗體陰性（用ELISA抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)）的健康仔豬10頭，攻毒組和對(duì)照組各5頭，攻毒組每頭豬滴鼻接種1 m L細(xì)胞分離毒（TCID50為10－4．625／m L），對(duì)照組滴鼻接種等量的 Marc－145細(xì)胞液。攻毒后隔離飼養(yǎng)，觀察14 d，每天測(cè)量體溫，觀察試驗(yàn)豬精神和食欲。攻毒后對(duì)死亡豬剖檢，采取肺、脾、腎和淋巴結(jié)等病料，用RT－PCR檢測(cè)淋巴結(jié)和肺組織中的PRRSV，于攻毒后14 d將活豬全部處死，取肺、脾、腎和淋巴結(jié)等病料，用RT－PCR檢測(cè)淋巴結(jié)和肺組織中的PRRSV。

1．2．7 分離株ORF4、ORF5基因的擴(kuò)增與克隆測(cè)序 參考文獻(xiàn)［4－5］設(shè)計(jì)引物，按建立的RT－PCR方法擴(kuò)增ORF4、ORF5基因，用小量膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，然后將其插入到p MD18－T載體多克隆位點(diǎn)后，構(gòu)建重組質(zhì)粒，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

1．2．8 HSJ－1102株 ORF4、ORF5基因序列分析

應(yīng)用DNA Star 5．0軟件，將獲得的HSJ－1102株基因序列與 GenBank中登錄的 VR2332、JXA1、Ch1－a株等PRRSV代表毒株，以及國(guó)內(nèi)多地區(qū)分離毒株的ORF4、ORF5基因序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行相似性分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2．1 病毒分離

疑似PRRSV病料組織無(wú)菌處理后接種于Marc－145細(xì)胞單層，37℃ 培養(yǎng)7 d，傳2代以后，即出現(xiàn)CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞圓縮、聚堆、脫落，形成病變?cè)?，?duì)照細(xì)胞無(wú)明顯變化。

2．2 分離株TCID50的測(cè)定

按Reed－Muench法計(jì)算分離病毒的TCID50為10－4．625／m L。

2．3 分離株的RT－PCR鑒定結(jié)果

對(duì)Marc－145細(xì)胞分離培養(yǎng)物進(jìn)行總RNA的提取，并利用特異引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10 g／L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果擴(kuò)增出678 bp的特異性條帶，與預(yù)期的擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符，對(duì)照為陰性（圖1）。

圖1 RT－PCR檢測(cè)分離病毒結(jié)果Fig．1 RT－PCR amplification of PRRSV

2．4 外源病毒排除試驗(yàn)

經(jīng)過PCR、RT－PCR檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)觀察，該分離株不含有偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒。

2．5 人工感染試驗(yàn)

對(duì)照組的5頭仔豬精神狀態(tài)、飲食、運(yùn)動(dòng)、體溫情況均無(wú)明顯異常，而接種感染組5頭仔豬均出現(xiàn)了不同程度呼吸系統(tǒng)癥狀，被毛粗亂、飲食減少、精神不良或沉郁，咳嗽、打噴嚏，體溫升高1℃～3℃，3頭仔豬出現(xiàn)耳根發(fā)紫，腹部發(fā)紺等現(xiàn)象，并與接種后14 d前死亡。剖檢出現(xiàn)明顯的間質(zhì)性肺炎表現(xiàn)，采集肺、脾、腎和淋巴結(jié)等病料進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，均能檢測(cè)到PRRSV核酸片段。

2．6 分離株ORF4基因的擴(kuò)增與序列分析

通過RT－PCR擴(kuò)增ORF4基因片段，成功連接轉(zhuǎn)化p MD18－T載體并測(cè)序，應(yīng)用DNA Star 5．0軟件對(duì)分離株的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，并與Gen Bank上基因1型經(jīng)典株VR2332株、基因2型LV株、CH1－a株，JXA1株，以及廣東、黑龍江、福建、河北、北京等地的分離株ORF4序列進(jìn)行核苷酸同相似分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析結(jié)果表明，本毒株ORF4 基因與 HQ843180、GQ241731（山西）、EF112447（河北）、GQ359108（山東）、JXA1株等高致病性毒株遺傳距離最近，與VR2332等毒株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。核苷酸相似性分析結(jié)果表明，該分離株ORF4基因序列與JXA1，Ch1－a等毒株的相似性較高，在97．4%～99．3%之間，與VR2332等毒株相似性低于90%（圖2）。

圖2 PRRSV HSJ－1102株的ORF4基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig．2 System development tree based on ORF4 gene sequence of HSJ－1102

2．7 分離株ORF5基因的擴(kuò)增與序列分析

RT－PCR擴(kuò)增 ORF5基因片段，連接轉(zhuǎn)化p MD18－T載體并測(cè)序，應(yīng)用DNA Star5．0軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列分析，并與GenBank上VR2332、LV、CH1－a、JXA1等代表毒株，以及廣東、黑龍江、福建、河南、北京等地的分離株ORF5序列進(jìn)行核苷酸相似性分析并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，相似結(jié)果可見，分離株 HSJ－1102與基因1型相似性較高，在86．4%至97．8%，與基因2型相似性較低，為54．4%，分離株 HSJ－1102 與 CH1－a株相似性 為92．5%，與經(jīng)典株 VR2332的相似性較差，為86．4%，與JXA1及廣東、江蘇等地區(qū)分離株相似性較高，為97%～99．8%。進(jìn)化樹分析可見分離株HSJ－1102屬于基因1型毒株，與河南株處于同一個(gè)分支（圖3）。

圖3 PRRSV HSJ－1102株的ORF5基因系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)生樹分析Fig．3 Phylogenetic tree based on ORF5 gene sequence of HSJ－1102

3 討論

由于不同PRRSV分離株核苷酸序列存在廣泛而明顯的變異，給PRRS的準(zhǔn)確檢測(cè)和有效控制帶來困難。特別是自2006年發(fā)生的以高熱、高發(fā)病率和高病死率為特征的傳染病以后，人們對(duì)PRRS投入了更多的關(guān)注。本研究采集黃河三角洲地區(qū)PRRS疑似病料，通過接種敏感細(xì)胞進(jìn)行PRRSV分離鑒定，成功獲得一株P(guān)RRSV，在 Marc－145細(xì)胞上增殖良好，能夠產(chǎn)生明顯細(xì)胞病變。通過PCR鑒定有效地排除其他病毒的存在，人工感染試驗(yàn)較好地復(fù)制出臨床發(fā)病模型，從而證明該分離株是一株高致病性PRRSV。

在對(duì)PRRSV主要蛋白結(jié)構(gòu)與功能研究中，人們對(duì)ORF4、ORF5基因編碼的糖基化囊膜蛋白GP4、GP5的研究十分關(guān)注［6－7］。研究表明，GP4蛋白是一種典型的1型膜蛋白結(jié)構(gòu)，包含有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，C末端功能區(qū)具有糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定作用［8］。GP4糖蛋白的158至162位殘基與病毒復(fù)制有關(guān)，而M162殘基對(duì)于病毒感染尤為重要，GP4糖蛋白能夠與細(xì)胞表面受體CD163分子在細(xì)胞膜上發(fā)揮共同作用，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞［9］。多項(xiàng)研究均報(bào)道GP4蛋白中存在PRRSV中和抗原表位，但是針對(duì)GP4的單克隆抗體的中和活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如GP5單克隆抗體［10］。GP5蛋白是病毒粒子表面含量最多的糖蛋白，因此稱作主要囊膜糖蛋白，GP5蛋白是受體表位識(shí)別蛋白，是能夠誘導(dǎo)中和抗體的主要蛋白［11］。GP5蛋白和病毒膜蛋白M蛋白由二硫鍵相連，在病毒粒子表面形成二聚體結(jié)構(gòu)，作為病毒囊膜蛋白的主要蛋白結(jié)構(gòu)［12］，與GP4一起，在病毒的吸附、病毒復(fù)制、病毒裝配、病毒變異和保護(hù)性反應(yīng)等方面發(fā)揮著重要作用。因此本研究通過基因克隆與測(cè)序分析，獲得了HSJ－1102分離株的ORF4和ORF5基因序列，并與國(guó)內(nèi)外流行株、經(jīng)典株進(jìn)行了比較分析［13－14］。通過分析發(fā)現(xiàn)，本毒株ORF4 基 因 與 HQ843180、GQ241731（山 西）、EF112447（河北）、GQ359108（山東）、JXA1株等高致病性毒株遺傳距離最近，尤其與GQ359108（山東）的核苷酸相似性為99．6%；本毒株ORF5基因與JXA1及廣東、江蘇等地區(qū)分離株相似性較高，均為97%以上，與EU200954株相似性達(dá)99．2%，因此判斷HSJ－1102分離株可能是黃河三角洲地區(qū)的流行株。

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Isolation，Identification and Genetic Analysis of ORF4，ORF5 Genes of PRRSV in Huanghe Delta Area

WU Yi－chun
（BiologyEngineeringDepartment，BinzhouVocationalCollege，Binzhou，Shandong，256603，China）

One porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）strain was isolated from a sick piglet in Huanghe delta area by inoculating it into Marc－145 cells．The isolated strain can induce Marc－145 cell cytopathic effect，with TCID5010－4．625／m L．PCR based on PRRSV NSP2 gene，pseudorabies virus，classical swine fever virus，porcine circovirus showed PRRSV positive and other viruses negative．Piglets artificial infected with the second passage cell cultures showed high fever，cough，cyanosis，blue ears，and even death．Obvious interstitial pneumonia can be found during postmortem inspection．Thus the isolated virus was confirmed as a highly pathogenic strain which named HSJ－1102 strain．Genetic analysis of ORF4 showed the strain was in a branch with JXA1，Ch1－a strains，with the identity 97．4%to 99．3%．The strain was in a different branch with VR－2332 strain，the identity was lower than 90．0%．Genetic analysis of ORF5 showed the strain was in a branch with JXA1 strain，with identity 97．0%to 99．8%．The strain was in a different branch with Ch1－a and VR－2332 strains，the identity was lower than 92．5%．

PRRSV；isolation and identification；ORF4；ORF5

S852．659．6

A

1007－5038（2012）06－0037－04

2012－04－01

濱州職業(yè)學(xué)院科研項(xiàng)目（10xykt06）

吳憶春（1976－），女，安徽安慶人，講師，碩士研究生，主要從事微生物學(xué)研究。