楊錦紅 劉 洋 王新林 李方去 陶洪群 李向陽
肺炎鏈球菌(streptococcus pneumoniae,S.p)在世界范圍內仍然是一種重要的病原體,可引起肺炎、腦膜炎、中耳炎、鼻竇炎及菌血癥等多種嚴重疾病[1,2]。對肺炎鏈球菌的診斷,目前主要依賴傳統(tǒng)方法——培養(yǎng)法進行檢測,但是培養(yǎng)法需要對微生物分離、培養(yǎng)和鑒定等檢測存在著耗時長、靈敏度低、操作繁瑣等缺點,對臨床快速診斷,尤其是侵襲性感染的診斷不及時,造成臨床治療上的延誤。隨著分子生物學技術的發(fā)展,肺炎鏈球菌的快速診斷研究進展迅速,其中有環(huán)介導等溫核酸擴增技術(LAMP)、PCR檢測核糖體(16SrRNA)、BOX-PCR、熒光定量PCR、免疫層析法、DNA探針雜交等,從基因/基因組的層面對肺炎鏈球菌進行快速診斷[3,4]。
1.菌株來源:2010年3~6月在溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院住院患兒送檢的呼吸道、血液及腦脊液標本分離的非重復的20株肺炎鏈球菌。質控菌株為肺炎鏈球菌ATCC49619。
2.儀器:Microscan Walkaway-90SI型全自動細菌鑒定儀(德國西門子公司)、PCR儀(德國Eppendorf公司產(chǎn)品)、電泳儀(美國BIO.RAD公司)、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一公司)
3.試劑:PCR試劑和DNA MarkerⅠ購于TaKaRa大連寶生物公司,引物參照文獻設計[5],由上海生工生物技術有限公司合成。限制性內切酶EcoRⅠ、MseⅠ購自Fermentas公司,DNA分子質量對照購自MBI公司。EcoRⅠ接頭、MseⅠ接頭、引物序列見表1。
4.菌種鑒定及藥敏試驗:挑選血平板上臍窩狀的可疑菌落分純,同時做奧普托欣(Optochin)試驗,再用 Microscan Walkaway-90SI型全自動細菌鑒定儀鑒定及藥敏試驗,判斷標準參照CLSI(2010版)標準。
5.AFLP實驗:根據(jù)張順等[6]報道的方法改進后用于實驗。(1)基因組DNA的制備:細菌DNA的制備:挑3~5個菌落調制成0.5麥氏點菌液,采取一系列稀釋梯度,配制成濃度依次為1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5×103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml的菌液,收集細菌采用CTAB法提取肺炎鏈球菌染色體DNA即為擴增檢測的模板液,用1%瓊脂糖電泳檢測基因組DNA,并用紫外分光光度計定量。(2)基因組DNA的雙酶切:取基因組DNA各2μl,內切酶EcoRⅠ5U、MseⅠ5U,10×Buffer 4μl,補水至40μl,先在37℃水浴5h,然后轉入65℃水浴2h,用1%瓊脂糖電泳檢測酶切產(chǎn)物。(3)接頭的連接反應:取酶切產(chǎn)物20μl,EcoR I Adapter、Mse I Adapter各1μl,T 4 DNA連接酶0.5μl,10× Buffer 3μl,補水至30μl,22℃,連接過夜。(4)PCR擴增:PCR擴增反應體系體積為25μl,上下游引物(20μmol/L)各0.5μl,dNTP(100mmol/L)2μl,模板 DNA 3μl,MgCl2(25mmol/L) 1.5μl,10×PCR buffer 2.5μl,EX Taq酶(5U/μl)0.125μl,ddH2O 14.375μl,混勻后進行擴增反應。循環(huán)參數(shù)為:94℃預變性4min,然后94℃15s→65℃30s→72℃15s共40個循環(huán),最后72℃延伸10min。(5)電泳分析:將產(chǎn)物放在6%的瓊脂凝膠中,150V電泳20min后用凝膠成像儀觀察DNA條帶的分布,產(chǎn)物片段多在100~600bp之間呈現(xiàn)出梯狀分布,特征性條帶明顯,具有較強的辨識度。
1.特異度試驗:檢測20株肺炎鏈球菌,結果均陽性(圖1)。15株非肺炎鏈球菌均陰性,金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、變形桿菌、陰溝腸桿菌、宋內志賀菌、傷寒沙門菌、粘質沙雷菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌及銅綠假單胞菌等多種細菌均為陰性,見圖2。表明AFLP-PCR具有良好的特異性。
圖1 20株肺炎鏈球菌AFLP圖譜1~19.肺炎鏈球菌臨床分離株;20.肺炎鏈球菌ATCC49619,M.Marker
圖2 特異性試驗AFLP結果
2.靈敏度試驗:經(jīng)活菌平板計數(shù),檢測細菌原液濃度為1.5×108CFU/ml,分別進行稀釋成為1.5× 108、1.5×107、1.5×106、1.5×105、1.5×104、1.5× 103、1.5×102、1.5×10、1.5CFU/ml,AFLP-PCR方法可檢測到第6個稀釋度,最低檢測濃度為1.5× 103CFU/ml,見圖3。
圖3 敏感性AFLP-PCR結果
傳統(tǒng)細菌培養(yǎng)分離生化鑒定方法作為細菌診斷的金標準,檢測肺炎鏈球菌,從微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學鑒定到生化分析,做出確診整個過程約需2~3天;而對于肺炎鏈球菌所致感染,尤其是侵襲性的深部感染,要求快速、方便的特點,該法不能滿足要求。近年來,以PCR技術為代表的病原核酸檢測技術得到不斷發(fā)展。其中,PCR、熒光定量PCR作為快速檢測技術得到了一定的應用。然而這些方法雖然可用于快速檢測,但因靈敏度和特異度上的差別,加上檢測費用較高,在現(xiàn)場使用有一定的局限性。擴增片段長度多態(tài)性快速檢測技術是病原核酸檢測技術上的長足進步,現(xiàn)已建立起來的AFLP-PCR具有高效、快速、簡便的優(yōu)越性,為及時快速檢測提供了新方法。
本研究中選擇了肺炎鏈球菌的特異基因作為靶序列,設計了兩對引物,對基因組DNA進行雙酶切后鏈接,優(yōu)化反應條件,選擇適宜的反應液配方,建立了AFLP方法檢測肺炎鏈球菌。該方法靈敏度高,最低可檢測到1.5×103CFU/ml,與其他PCR快速診斷檢測水平相當[7,8];特異度高,未出現(xiàn)假陰性和假陽性,本研究所用20株肺炎鏈球菌均能檢測出來,而15株非肺炎鏈球菌,包括金黃色葡萄球菌、草綠色鏈球菌等革蘭陽性菌,也包括大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭陰性菌,均未檢測出來,表明特異度高,并且電泳圖形具有一定的可識別性。
為了及時準確地檢測出疑似病例是否為肺炎鏈球菌感染,需要有靈敏特異的檢測方法。提取細菌DNA進行肺炎鏈球菌病原學的鑒定,尤其是與菌落形態(tài)與其相似的草綠色鏈球菌鑒別,是人們一直在尋找的方法。AFLP簡單、快速、敏感性好、特異性高,本研究AFLP條帶較多,特征性強,分辨率較高,能可靠地檢測出肺炎鏈球菌的同時,還可以分析出親緣關系,適合肺炎鏈球菌的早期診斷,尤其是無菌體液中的侵襲性感染,有著較大的診斷意義。
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3 胡曉彥,桂炳東,王伶,等.BOX-PCR技術在肺炎鏈球菌的檢測中的應用[J].實驗與檢驗醫(yī)學,2010,28(3):209-211
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