趙 明，張 娟，高 錦，嵇 楊，祁冰潔，趙春杰

（1.解放軍總后勤部衛(wèi)生部藥品儀器檢驗(yàn)所質(zhì)量保證室，北京100071；2.沈陽(yáng)藥科大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，沈陽(yáng)110016；3.解放軍第309醫(yī)院重癥肌無(wú)力科，北京100091）

胞磷膽堿鈉是一種神經(jīng)保護(hù)劑，是內(nèi)源性合成磷脂酰膽堿的中間體，為卵磷脂生物合成所必需的輔酶［1］。作為臨床常用的神經(jīng)激活劑，不同廠家胞磷膽堿鈉注射液的處方及生產(chǎn)工藝各不相同，有的處方中不添加任何輔料，有的添加焦亞硫酸鈉（Na2S2O5），且不同廠家加入量各不相同。焦亞硫酸鈉是抗氧化劑，氧化后的殘留物亞硫酸鹽可引起包括細(xì)胞損傷、支氣管痙攣和過(guò)敏在內(nèi)的高度敏感性反應(yīng)，其過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率較高，有的甚至危及生命，故應(yīng)對(duì)其加入量進(jìn)行控制，以提高產(chǎn)品的安全性。焦亞硫酸鈉作為藥用輔料在《中華人民共和國(guó)藥典》2010版二部［2］中收載，采用碘量滴定法進(jìn)行含量測(cè)定，此法適用于輔料純品的含量測(cè)定，而胞磷膽堿鈉本身含有還原性基團(tuán)，會(huì)干擾碘量法的測(cè)定結(jié)果。因此，建立高效、快速、準(zhǔn)確、適于測(cè)定胞磷膽堿鈉注射液中焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定方法很有必要。有關(guān)胞磷膽堿鈉注射液中焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定方法國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究根據(jù)焦亞硫酸鈉在酸性溶液中釋放出的二氧化硫能使酸性品紅溶液褪色的性質(zhì)，建立了胞磷膽堿鈉注射液中焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器和試藥

UV－2550型紫外－可見(jiàn)分光光度儀（日本島津公司）；MES 235S電子天平（美國(guó)Starious公司）；無(wú)水亞硫酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA－2Na）（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；酸性品紅、結(jié)晶乙酸鈉（分析純，北京化工廠）；冰乙酸（分析純，天津市康科德科技有限公司）。胞磷膽堿鈉注射液由國(guó)內(nèi)藥品生產(chǎn)廠A（批號(hào)100309、100524）、B（批號(hào)09053006、09080314、09090310、09100316、09100318、 09100319、09100320、10010324、10010325、10010503、10010514、10010521、10030312）、C（090330410、091120800）提供。水為二次重蒸水。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液制備 （1）酸性品紅溶液：精密稱取酸性品紅0.34g，加硫酸1ml，加水溶解至1 000ml（7d內(nèi)使用）。（2）乙酸鹽緩沖液（pH＝4.8）：稱取結(jié)晶乙酸鈉136.1g，EDTA－2Na 0.4g，加入冰乙酸57ml，加水溶解并定容至1 000ml。（3）亞硫酸鈉對(duì)照品溶液：精密稱取無(wú)水亞硫酸鈉55.0mg，用0.04%EDTA－2Na溶液溶解并定容至25ml。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 精密量取酸性品紅溶液8.0ml，共2份，分別置50ml量瓶中，各加乙酸鹽緩沖液約30ml，分別加入亞硫酸鈉對(duì)照品和供試品溶液各1.0ml，用乙酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置。在400～700nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)做掃描，對(duì)照品及供試品在549nm波長(zhǎng)處有最大吸收，選擇549nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的考察 按2.2項(xiàng)下方法配制反應(yīng)液后搖勻，室溫放置，于不同時(shí)間測(cè)定吸光度（A）。結(jié)果表明，在室溫條件下，溶液的A值逐漸降低，在25min后穩(wěn)定，表明反應(yīng)已完全，故將反應(yīng)時(shí)間定為25min。

2.4 陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn) 精密量取酸性品紅溶液8.0ml，共2份，分別置50ml量瓶中，各加乙酸鹽緩沖液約30ml，分別加入自制不含焦亞硫酸鈉的胞磷膽堿鈉注射液與乙酸鹽緩沖液各1.0ml，用乙酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置25min，測(cè)定在549nm處的A值。兩者在549nm波長(zhǎng)處的A值一致，故胞磷膽堿鈉不干擾焦亞硫酸鈉的測(cè)定，且乙酸鹽緩沖液在放置0min與25min時(shí)A值一致，表明酸性品紅溶液自身顏色在室溫放置25min內(nèi)不會(huì)逐漸減褪。

2.5 測(cè)定方法 精密量取酸性品紅溶液8.0ml，置50ml量瓶中，加乙酸鹽緩沖液約30ml，精密加入胞磷膽堿鈉注射液1.0ml，用乙酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，室溫放置25min。以乙酸鹽緩沖液為空白對(duì)照，在549nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。

2.6 線性范圍考察 精密量取酸性品紅溶液8.0ml，共8份，分別置50ml量瓶中，各加乙酸鹽緩沖液約30ml，精密加入對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0ml，按2.5項(xiàng)下操作，測(cè)定A值。以對(duì)照品溶液A值的倒數(shù)（1／A）與其濃度（c）進(jìn)行線性擬合，無(wú)水亞硫酸鈉的濃度在4.44～177.6μg／ml范圍內(nèi)，即焦亞硫酸鈉濃度在3.35～133.9μg／ml范圍內(nèi)，1／A與濃度c呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為1／A＝0.114 2 c＋0.301 3，r＝0.999 6。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批供試品6份，分別測(cè)定含量，結(jié)果RSD為1.18%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取無(wú)水亞硫酸鈉對(duì)照品80、100、120mg，分別置50ml量瓶中，用0.04%的EDTA－2Na溶液溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。精密量取酸性品紅溶液8.0ml，共9份，分別置50ml量瓶中，各加乙酸鹽緩沖液約30ml，分別精密加入對(duì)照品溶液0.5ml，再分別精密加入已知含量的供試品溶液0.5ml，并用乙酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，按2.5項(xiàng)下方法操作，求得平均加樣回收率為96.4%，RSD為2.0%（n＝9）。

2.9 含量測(cè)定 照2.5項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液的A值。按2.6項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。樣品測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同廠家胞磷膽堿鈉注射液中焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，±s，ρB／mg·ml－1）

表1 不同廠家胞磷膽堿鈉注射液中焦亞硫酸鈉的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，±s，ρB／mg·ml－1）

企業(yè) 批號(hào) 處方量 測(cè)定值A(chǔ) 100309 1.5 1.384±0.001 A 100524 1.5 1.474±0.002 B 09053006 0 1.020±0.001 B 09080314 0 0.940±0.003 B 09090310 0 0.834±0.001 B 09100316 0 0.928±0.002 B 09100318 0 0.984±0.003 B 09100319 0 0.961±0.001 B 09100320 0 0.938±0.001 B 10010324 0 0.940±0.003 B 10010325 0 0.969±0.001 B 10010503 0 0.907±0.004 B 10010514 0 0.944±0.002 B 10010521 0 0.897±0.002 B 10030312 0 0.996±0.001 C 090330410 0 0 C 091120800 0 0

3 討 論

3.1 反應(yīng)原理 焦亞硫酸鈉中含有兩個(gè)＋4價(jià)的硫，亞硫酸鈉（Na2SO3）中含有一個(gè)＋4價(jià)的硫，因此發(fā)生氧化還原反應(yīng)時(shí)，2mol的亞硫酸鈉相當(dāng)于1mol的焦亞硫酸鈉，即2.52g的亞硫酸鈉相當(dāng)于1.90g的焦亞硫酸鈉。

3.2 測(cè)定結(jié)果分析 本研究所建立的方法可準(zhǔn)確測(cè)定胞磷膽堿鈉注射液中加入焦亞硫酸鈉的含量，從而準(zhǔn)確判斷樣品中是否非法添加焦亞硫酸鈉。本研究通過(guò)對(duì)3個(gè)廠家17批樣品進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)B廠共13批樣品均未按處方量規(guī)定，擅自添加焦亞硫酸鈉，存在一定安全隱患。焦亞硫酸鈉極易被氧化，在生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)有不同程度的損耗，故A廠2批樣品測(cè)得值比處方量偏小，并可能出現(xiàn)一定差異。

3.3 比色反應(yīng)條件 姚克榮等［3］認(rèn)為焦亞硫酸鈉與酸性品紅溶液的顯色反應(yīng)條件應(yīng)控制為28℃水浴15min，吳小曼等［4］認(rèn)為反應(yīng)溫度不重要，關(guān)鍵是對(duì)照品溶液與供試品溶液同時(shí)平行操作，室溫下放置25min。作者發(fā)現(xiàn)在室溫下放置25～40min，A均保持穩(wěn)定。因焦亞硫酸鈉極易被氧化成硫酸鹽，因此含量測(cè)定應(yīng)在樣品開(kāi)封后立即取樣，以減小誤差。3.4 對(duì)照品的選擇及配制 焦亞硫酸鈉具有極易被氧化的特性，不宜作為對(duì)照品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，應(yīng)選擇相對(duì)穩(wěn)定的無(wú)水亞硫酸鈉作為對(duì)照品，且配制亞硫酸鈉對(duì)照品溶液時(shí)選用0.04%的EDTA－2Na溶液稀釋定容，可有效防止亞硫酸鈉對(duì)照品被氧化，增加測(cè)定結(jié)果的可靠性。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行含量測(cè)定，可以在一定程度上降低測(cè)定誤差。

3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線 姚克榮等［3］認(rèn)為，亞硫酸鹽濃度與1／A呈線性關(guān)系，吳小曼等［4］認(rèn)為按雙對(duì)數(shù)方式擬合得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其相關(guān)系數(shù)要優(yōu)于倒數(shù)方式。作者采用兩種方式進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，發(fā)現(xiàn)亞硫酸鹽濃度與1／A的線性關(guān)系較好。

［1］ 顧復(fù)昌，楊亮懿.胞二磷膽堿的生產(chǎn)［J］.發(fā)酵科技通訊，2007，36（1）：9－11.

Gu FuChang，Yang LiangYi.The production of citicoline［J］.Ferment Sci Technol Commun，2007，36（1）：9－11.In Chinese.

［2］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010年版二部［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1238.

State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia of the People’s Republic of China.2010ed.Volume 2［S］.Beijing：Chinese Medical Science Press，2010：1238.In Chinese.

［3］ 姚克榮，徐連連.影響復(fù)方氨基酸注射液中焦亞硫酸鈉含量測(cè)定的因素［J］.中國(guó)生化藥物雜志，1997，18（3）：132－134.

Yao KeRong，Xu LianLian.Factors affecting the determination of the content of sodium pyrosulfite in complex amino acids injection［J］.Chin J Biochem Pharm，1997，18（3）：132－134.In Chinese with English abstract.

［4］ 吳小曼，紀(jì) 宇.比色法測(cè)定復(fù)方氨基酸注射液（18AA－Ⅰ）中焦亞硫酸鈉的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2007，8（5）：38－40.

Wu XiaoMan，Ji Yu.Content determination of sodium pyrosulfite in compound amino acid injection（18AA－Ⅰ）by the colorimetric method［J］.Drug Stand China，2007，8（5）：38－40.In Chinese with English abstract.