余自成，江 濤，瞿江媛，田薇薇，馬明華，陳紅君，陳紅專

（1.上海市楊浦區(qū)中心醫(yī)院臨床藥學(xué)和藥理學(xué)研究室，上海200090；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，上海200025）

嗎替麥考酚酯（mycophenolate mofetil，MMF）是一種重要的免疫抑制藥物，已獲準(zhǔn)用于預(yù)防腎臟、肝臟和心臟移植器官排異反應(yīng)，作為免疫抑制首選藥物在臨床廣泛應(yīng)用［1］。MMF為前體藥物，口服給藥后轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚援a(chǎn)物麥考酚酸（mycophenolic acid，MPA），發(fā)揮免疫抑制作用。本研究建立了HPLC－MS／MS法同時(shí)測定轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中MMF和 MPA的濃度，用于研究MMF和MPA穿透Caco－2細(xì)胞單層的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，評價(jià)P－糖蛋白（P－glycoprotein，P－gp）在兩者腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Agilent 1200型HPLC儀，包括Quat Pump G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1314B可變波長紫外檢測器、G1322A在線真空脫氣機(jī)和G1316A柱溫箱；6410三重串聯(lián)四極桿LC／MS儀和Mass Hunter工作站軟件（美國Agilent公司）；BS224S型精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；Delta 320型pH計(jì)（梅特勒－托利多儀器有限公司）；XW－80A旋渦混合器（原上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；M型移液器（法國Gilson儀器有限公司）；Milli－Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 藥品和試劑 嗎替麥考酚酯對照品（純度99.0%，德國羅氏診斷有限公司）；麥考酚酸對照品（純度99.8%，羅氏生物科技公司）；吲哚美辛對照品（純度99.2%美國Sigma－Aldrich公司）；D－葡萄糖（英國Biotech Bio Basic公司）；4－羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，高純度，上海生工生物工程有限公司）；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院自制）。

2 方法和結(jié)果

2.1 溶液的配制 （1）MMF儲(chǔ)備液：精密稱取MMF對照品9.4mg，加二甲亞砜（DMSO）216.8μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MMF對照品儲(chǔ)備液。（2）MPA儲(chǔ)備液：精密稱取MPA對照品6.8mg，加DMSO 212μl溶解，混勻，即得濃度為100mmol／L的MPA對照品儲(chǔ)備液。（3）Hank平衡鹽溶液（Hanks balanced salt solution，HBSS）：精密稱取CaCl2140mg、KCl 400mg、KH2PO460mg、MgCl2·6H2O 100mg、NaCl 8g、Na2HPO4、MgSO4·7H2O 100mg、NaHCO3350mg、48mg、D－葡萄糖4.5g和HEPES 5.95g，加超純水溶解并稀釋至1 000ml，用1mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.4，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，分裝，置于4℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?）吲哚美辛（內(nèi)標(biāo)）儲(chǔ)備液：精密稱取吲哚美辛對照品3.0mg，加DMSO 1.0ml溶解，搖勻，即得濃度為3mg／ml的吲哚美辛儲(chǔ)備液。精密移取吲哚美辛儲(chǔ)備液50μl，加HBSS溶液稀釋至5ml，搖勻，即得30μg／ml的吲哚美辛對照品溶液。（5）樣品溶液：取轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)樣品0.1ml，置于1.5ml塑料離心管中，加入內(nèi)標(biāo)溶液（30μg／ml）5μl，渦旋振蕩30s，混勻，吸取上清液作為樣品溶液。上述溶液均置－40℃低溫冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件 色譜柱：Zorbax Eclipse XDB－C18柱（50mm×2.1mm，3.5μm）；流動(dòng)相：A相（甲醇，含0.05%甲酸），B相（水，含0.05%甲酸）；梯度洗脫：0～3.60min，40%A，流速：0.3ml／min，3.61～7.00min，65%A，流速：0.6ml／min，7.01～10.00min，40%A，流速：0.6ml／min；柱溫：30℃。2.3 質(zhì)譜檢測條件 采用電噴霧離子源（ESI），離子源溫度100℃，毛細(xì)管電壓4.0kV，去溶劑氣溫度350℃，去溶劑氣流速9.0L／min，碰撞氣為N2，霧化氣壓力206.9kPa，離子駐留時(shí)間均為200ms。檢測方式為多種反應(yīng)監(jiān)測（MRM），用于定量分析監(jiān)測的離子反應(yīng)為MMF：m／z 433.8→194.8，離子極性為正離子，錐孔電壓150V，碰撞能量35eV；MPA：m／z319.1→191.0，離子極性為負(fù)離子，錐孔電壓165V，碰撞能量30eV；吲哚美辛：m／z 356.0→312.1，離子極性為負(fù)離子，錐孔電壓80V，碰撞能量5eV。

2.4 色譜－質(zhì)譜行為 在2.2項(xiàng)色譜條件和2.3項(xiàng)質(zhì)譜條件下，取HBSS溶液，添加MMF對照品、MPA對照品和吲哚美辛對照品的HBSS溶液，以及樣品溶液分別進(jìn)樣，在各自的離子通道上采集數(shù)據(jù)。結(jié)果MMF、MPA和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為4.16、6.38和8.49min，色譜峰形較好，能夠完全分離，色譜圖見圖1。

圖1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸的HPLC－MS／MS譜圖Figure 1 HPLC－MS／MS photograms of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 離子抑制實(shí)驗(yàn) 將MMF和MPA分別用甲醇、流動(dòng)相和HBSS溶液溶解后進(jìn)樣測定，考察離子化過程中由HBSS溶液殘留介質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的離子抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同溶劑對MPA的質(zhì)譜檢測信號影響相似，用甲醇和流動(dòng)相溶解質(zhì)譜檢測信號強(qiáng)度相同，用HBSS溶液溶解較甲醇和流動(dòng)相溶解質(zhì)譜檢測信號強(qiáng)度略有下降，但差別不明顯，而將HBSS溶液中鹽份切換與不切換至廢液的質(zhì)譜檢測信號強(qiáng)度相同。但溶劑不同對MMF的質(zhì)譜檢測信號影響差異較大，信號強(qiáng)度由大到小依次為：流動(dòng)相＞甲醇＞HBSS溶液。用流動(dòng)相溶解，質(zhì)譜檢測信號約為用HBSS溶液溶解時(shí)的兩倍，而將HBSS溶液中鹽份切換至廢液可以提高檢測信號強(qiáng)度。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備和最低檢測濃度 用空白HBSS溶液將MMF和MPA對照品儲(chǔ)備液稀釋，分別配制成系列濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00、10.00、20.00μmol／L的溶液，按照樣品測定方法操作，以內(nèi)標(biāo)法定量。以MMF、MPA與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比（As／Ai）為縱坐標(biāo)，濃度（c）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。MMF和MPA在0.01～20μmol／L范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，MMF的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：As／Ai＝－0.035 2＋0.394 5 c（r＝0.999 1），MPA為As／Ai＝0.005 5＋0.050 8 c（r＝0.999 5）。以信噪比（S／N）≥3為標(biāo)準(zhǔn)，測得MMF和MPA的最低檢測濃度分別為0.005、0.001μmol／L。

2.5.3 精密度和回收率實(shí)驗(yàn) 用適量空白HBSS溶液將MMF和MPA對照品儲(chǔ)備液稀釋，配成濃度為0.10、1.50和15.00μmol／L的對照品質(zhì)控樣品，按照2.2項(xiàng)下色譜條件和2.3項(xiàng)下質(zhì)譜條件，在同一天重復(fù)測定5份，計(jì)算日內(nèi)RSD。每天測定1份，連續(xù)測定5d，計(jì)算日間RSD。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算濃度，以測得濃度與配制濃度的比值計(jì)算方法回收率。結(jié)果表明，MMF的日內(nèi)RSD＜6.02%，日間RSD＜7.27%；3種濃度的回收率分別為（103.2±7.5）%、（97.3±3.1）%和（96.0±3.4）。MPA的日內(nèi)RSD＜8.85%，日間RSD＜9.25%；3種濃度的回收率分別為（106.9±1.0）%、（106.0± 5.7）%和（108.4±3.2）（n＝5）。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將MMF和MPA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品于室溫（20℃）放置48h、37℃培養(yǎng)箱放置4h、4℃冰箱放置1周，以及－20℃冰箱放置3個(gè)月，測定濃度，評價(jià)樣品穩(wěn)定性，結(jié)果見表1。

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

表1 嗎替麥考酚酯和麥考酚酸穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of stability tests of mycophenolate mofetil and mycophenolic acid（n＝3，±s，cB／μmol·L－1）

個(gè)月嗎替麥考酚酯濃度 20℃放置48h 37℃放置4h 4℃放置1周－20℃放置3 1.50 1.49±0.01 1.45±0.01 1.43±0.01 1.45±0.05 15.00 14.76±0.40 14.82±0.77 14.30±0.15 14.25±0.34麥考酚酸1.50 1.49±0.02 1.48±0.05 1.46±0.06 1.45±0.03 15.00 15.33±0.46 14.68±0.09 14.22±0.33 14.60±0.45

3 討 論

對Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品的分析通常采用HPLC法［2，3］，但是這些檢測器靈敏度較低，特別是紫外檢測器對多數(shù)化合物的檢測靈敏度均不夠。MS法作為一種新的檢測技術(shù)，在藥物代謝研究中正發(fā)揮著越來越重要的作用，特別是HPLC－MS／MS法因具有更好的專屬性和靈敏度而被公認(rèn)為是目前用于生物樣品定性和定量分析最為理想的方法。研究者將HPLC－MS／MS法用于Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品的分析［4，5］。本研究建立了一種具有較高靈敏度和準(zhǔn)確度的HPLC－MS／MS方法用于測定Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)樣品中MMF和MPA的濃度，MMF和MPA理化性質(zhì)差異較大。通過梯度洗脫的方法，優(yōu)化梯度條件，實(shí)現(xiàn)了在同一色譜條件下對兩者的同時(shí)檢測。本方法測定的線性范圍為0.01～20.00μmol／L，能夠包括轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)中所有樣品的MMF和MPA濃度，精密度、回收率和穩(wěn)定性等均能滿足分析測定的要求。本研究使用吲哚美辛作為內(nèi)標(biāo)物，而未使用與MPA結(jié)構(gòu)相近的丁氧羧基醚化麥考酚酸（MPAC），主要原因是MPAC的離子碎片會(huì)給MMF和MPA的含量測定帶來離子污染，干擾MMF和MPA低濃度時(shí)的測定。由于對照品的量較少，本研究以對照品直接加入二甲亞砜中配制對照品儲(chǔ)備液。

轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)中高濃度鹽會(huì)導(dǎo)致離子抑制作用，影響檢測靈敏度。因此，在分析測定時(shí)需要脫鹽處理，應(yīng)在樣品進(jìn)入質(zhì)譜離子源之前去除無機(jī)鹽，以避免出現(xiàn)檢測信號抑制及離子源污染［6］。離子抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HBSS溶液中無機(jī)鹽的存在對MMF檢測有較大影響，對MPA檢測影響較小。通過軟件系統(tǒng)控制，在樣品進(jìn)入質(zhì)譜離子源之前使用切換閥可以將HBSS溶液中大部分的鹽份切換至廢液，顯著提高檢測信號強(qiáng)度，但殘留的少量鹽份仍然會(huì)導(dǎo)致一定的離子抑制作用。因此為了獲得有關(guān)MMF、MPA穿過Caco－2細(xì)胞單層轉(zhuǎn)運(yùn)的準(zhǔn)確信息，所有樣品應(yīng)維持相同的無機(jī)鹽含量。

［1］ Allison A C，Eugui E M.Mechanisms of action of mycophenolate mofetil in preventing acute and chronic allograft rejection［J］.Transplantation，2005，80（2Suppl）：S 181－S 190.

［2］ Ucpinar S D，Stavchansky S.Quantitative determination of saquinavir from Caco－2cell monolayers by HPLC－UV.High performance liquid chromatography［J］.Biomed Chromatogr，2003，17（1）：21－25.

［3］ Zhou S，Li Y，Kestell P，et al.Determination of thalidomide in transport buffer for Caco－2cell monolayers by high－performance liquid chromatography with ultraviolet detection［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2003，785（1）：165－173.

［4］ Wang Z，Hop C E，Leung K H，et al.Determination of in vitro permeability of drug candidates through a caco－2cell monolayer by liquid chromatography／tandem mass spectrometry［J］.J Mass Spectrom，2000，35（1）：71－76.

［5］ Smalley J，Kadiyala P，Xin B，et al.Development of an on－line extraction turbulent flow chromatography tandem mass spectrometry method for cassette analysis of Caco－2cell based bi－directional assay samples［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，830（2）：270－277.

［6］ Hakala K S，Laitinen L，Kaukonen A M，et al.Development of LC／MS／MS methods for cocktail dosed Caco－2samples using atmospheric pressure photoionization and electrospray ionization［J］.Anal Chem，2003，75（21）：5969－5977.