劉珍仁，葉曉嵐，2，范國(guó)榮＊，張大志，黃景華

［1.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200433；2.廣東藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，廣州510006；3.第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室，上海200433；4.廣東八加一醫(yī)藥有限公司，廣州510515］

鹽酸苯達(dá)莫司汀（bendamustine hydrochlo－ride，BDH），化學(xué)名：4－｛5′－［雙－（2′′－氯乙基）氨基］－1′－甲基－2′－苯并咪唑基｝－丁酸鹽酸鹽，最早于19世紀(jì)60年代初由Ozegowski及其同事在德國(guó)耶拿的微生物試驗(yàn)協(xié)會(huì)研制成功。他們使一種烷基化氮芥（一種非功能烷化劑）連接一個(gè)嘌呤和氨基酸，變成一種雙功能基烷化劑，通過(guò)烷化作用使DNA單鏈和雙鏈交聯(lián)，干擾DNA的功能和合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［1］，其化學(xué)結(jié)構(gòu)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 鹽酸苯達(dá)莫司汀的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Chemical structure of bendamustine hydrochloride

BDH作為新一代抗癌藥物，對(duì)多種癌癥具有明顯的治療作用，可用于治療霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病和乳腺癌等多種惡性腫瘤。美國(guó)FDA于2008－03－21批準(zhǔn)Cephalon公司開(kāi)發(fā)的BDH用于慢性淋巴細(xì)胞性白血病的治療，商品名為T(mén)reanda。2008－10－31該藥又獲準(zhǔn)用于惰性B細(xì)胞非霍奇金淋巴瘤的治療［2］。2010年，Mundipharma公司宣布，歐洲醫(yī)藥管理局（EMEA）推薦在德國(guó)及歐盟其他成員國(guó)，如奧地利、比利時(shí)、丹麥等批準(zhǔn)BDH用于治療惰性非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病及多發(fā)性骨髓瘤［3］。目前，BDH尚未在中國(guó)大陸申請(qǐng)專(zhuān)利，也沒(méi)有制藥企業(yè)進(jìn)行生產(chǎn)和銷(xiāo)售，因此本品開(kāi)發(fā)的潛力巨大。

目前大部分文獻(xiàn)主要涉及BDH的藥理、臨床藥效以及體內(nèi)外代謝的研究［4－7］，但對(duì)于其質(zhì)譜裂解規(guī)律尚未見(jiàn)報(bào)道。為了研究BDH的結(jié)構(gòu)特征及其裂解途徑，本研究采用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜（ESI－MSn）技術(shù)對(duì)BDH質(zhì)譜裂解途徑進(jìn)行分析，找出主要的特征碎片離子及其質(zhì)譜電離裂解規(guī)律，為BDH的結(jié)構(gòu)修飾及其代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)判斷提供依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器 LCQ fleet質(zhì)譜儀、ESI離子源、離子阱質(zhì)量分析器和XcaliburTM2.0.7SP1數(shù)據(jù)處理軟件（美國(guó)Thermo Fisher公司），XW－80A渦旋混合器（上海精科實(shí)驗(yàn)有限公司），XS205電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 試藥 BDH原料藥（批號(hào)：20110523，純度99.87%，由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院有機(jī)化學(xué)教研室提供）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；超純水由第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室自制。

2 方法和結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件

2.1.1 正離子模式 電噴霧電壓4.5kV；鞘氣流速241.15kPa；輔助氣流速2.4L／min；毛細(xì)管溫度350℃；毛細(xì)管電壓35V；透鏡電壓95V；碰撞誘導(dǎo)解離能量35V。

2.1.2 負(fù)離子模式 電噴霧電壓－4.5kV；鞘氣流速241.15kPa；輔助氣流速－2.4L／min；毛細(xì)管溫度350℃；毛細(xì)管電壓－35V；透鏡電壓－95V；碰撞誘導(dǎo)解離能量35V。

2.2 樣品溶液的配制 精密稱(chēng)量BDH原料藥10mg，置于10ml棕色量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取該儲(chǔ)備液適量，用甲醇逐級(jí)稀釋至1.0μg／ml的樣品溶液，備用。

2.3 BDH在正離子模式下的質(zhì)譜解析 將1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜檢測(cè)器調(diào)為正離子模式，獲得其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖。從中可以觀察到分子離子峰［M＋H］＋m／z 358。同時(shí)在一級(jí)質(zhì)譜圖中可以看到較強(qiáng)的離子峰m／z 360和m／z362，這是由于BDH結(jié)構(gòu)中有2個(gè)Cl，而同位素37Cl的豐度比很大。根據(jù)同位素豐度比公式，即二項(xiàng)式（a＋b）n（a與b為輕質(zhì)35Cl及重質(zhì)同位素37Cl的豐度比，n為Cl原子數(shù)目），BDH一級(jí)質(zhì)譜圖中會(huì)出現(xiàn)M、M＋2及M＋4峰，且豐度比為9∶6∶1，與質(zhì)譜圖中的結(jié)果吻合，即［M＋H＋2］＋m／z360、［M＋H＋4］＋m／z362分別是含1個(gè)和2個(gè)同位素37Cl的分子離子峰。

在二級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中，可以觀察到m／z 340為最強(qiáng)離子峰，結(jié)合系統(tǒng)自帶的質(zhì)譜解析軟件，此離子峰為準(zhǔn)分子離子［M＋H］＋m／z358失去一分子H2O生成的產(chǎn)物離子［M＋H－18］＋。三級(jí)全掃描質(zhì)譜顯示有3個(gè)主要離子峰m／z 304、m／z 276和m／z228。離子峰m／z 304是二級(jí)離子碎片m／z 340失去一分子HCl而生成的產(chǎn)物離子；m／z 276是二級(jí)碎片離子m／z340先失去一分子CO后再失去一分子HCl而得到的離子碎片；m／z 228為離子碎片m／z 358斷裂一分子CH2CH2Cl和一分子CH2Cl得到m／z 246的離子碎片，m／z 246再失去一分子H2O后得到m／z 228碎片離子峰。在四級(jí)全掃描質(zhì)譜圖中，主要有m／z 240、m／z 268和m／z 276 3個(gè)碎片離子峰，均是三級(jí)離子碎片m／z 304分別失去一分子CH2CH2Cl、HCl和CH2＝CH2生成的產(chǎn)物離子。從圖中可以發(fā)現(xiàn)三級(jí)和四級(jí)質(zhì)譜棒圖中均有m／z276離子碎片峰，說(shuō)明該離子碎片既可以由m／z 340裂解產(chǎn)生，也可以從m／z 304離子碎片裂解生成。其中正離子模式下質(zhì)譜裂解棒圖見(jiàn)圖2，化合物裂解碎片結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3，裂解碎片結(jié)構(gòu)樹(shù)見(jiàn)圖4。

圖2 鹽酸苯達(dá)莫司汀正離子模式下的多級(jí)質(zhì)譜圖Figure 2 MS／MSn photograms of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

圖3 鹽酸苯達(dá)莫司汀正離子模式下的裂解途徑Figure 3 Fragmentation pathways of bendamustine hydrochloride in positive ion mode

圖4 m／z 358的分子離子在正離子模式下的碎片裂解結(jié)構(gòu)樹(shù)Figure 4 Fragmentation crack tree of molecular ion m／z 358in positive ion mode

2.4 BDH在負(fù)離子模式下的質(zhì)譜解析 將1.0μg／ml的BDH甲醇溶液直接注入質(zhì)譜儀，質(zhì)譜檢測(cè)器調(diào)為負(fù)離子模式，獲得其一級(jí)全掃描質(zhì)譜圖（見(jiàn)圖5）。從中可以觀察到分子離子峰［M－H］－m／z 356，還可以看到同位素37Cl的分子離子峰［M－H＋2］－m／z358和［M－H＋4］－m／z360。二級(jí)選擇m／z356作為母離子進(jìn)行轟擊，質(zhì)譜圖上基本無(wú)響應(yīng)。

圖5 鹽酸苯達(dá)莫司汀負(fù)離子模式下的一級(jí)質(zhì)譜圖Figure 5MS photogram of bendamustine hydrochloride in negative ion mode

3 討 論

利用ESI－MSn，根據(jù)軟電離模式下能產(chǎn)生多級(jí)離子碎片的特點(diǎn)，可以推測(cè)BDH的裂解方式和碎片離子結(jié)構(gòu)。BDH結(jié)構(gòu)中的羥基、羰基以及氯乙基等位置容易發(fā)生斷裂，產(chǎn)生一系列碎片離子。BDH在體內(nèi)經(jīng)水解后的代謝產(chǎn)物主要是羥基取代氯原子［8］，這與BDH在質(zhì)譜中容易發(fā)生裂解的位置很相似，因此BDH的質(zhì)譜裂解規(guī)律對(duì)其在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)判定有一定的提示作用。

由于BDH結(jié)構(gòu)中有一個(gè)羧基，在正離子模式下，羧基易以CO和H2O的形式丟失；5′位C上的N直接相連的兩個(gè)氯乙基中的氯原子也容易以HCl的形式脫去；同時(shí)氯乙基也可以通過(guò)斷裂與氯原子相鄰的亞甲基的方式進(jìn)行裂解，或者氯乙基直接斷裂，說(shuō)明這幾個(gè)位置都容易發(fā)生裂解產(chǎn)生新的離子碎片。而其中苯并咪唑環(huán)比較穩(wěn)定，通過(guò)多級(jí)質(zhì)譜裂解，均未發(fā)現(xiàn)與其相關(guān)的裂解碎片。

負(fù)離子模式下，通過(guò)多級(jí)能量轟擊，只有一級(jí)分子離子峰［M－H］－m／z 356有一定的響應(yīng)，ESI－MS2后基本上無(wú)響應(yīng)，分別增加樣品濃度和進(jìn)樣量，響應(yīng)也未發(fā)生明顯的增加，說(shuō)明BDH主要通過(guò)正離子模式進(jìn)行裂解產(chǎn)生碎片，負(fù)離子模式下則比較穩(wěn)定，各鍵不容易發(fā)生斷裂。這與BDH結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)N原子有關(guān)，容易失去電子而帶正電荷。

總之，本研究采用ESI－MSn對(duì)BDH的質(zhì)譜裂解方式做了初步的分析，為BDH的結(jié)構(gòu)修飾及其代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)判斷提供了參考依據(jù)。

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