段 楓

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100048)

實驗性自身免疫性肌炎動物模型的制作

段 楓

(中國人民解放軍海軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,北京 100048)

目的探討實驗性自身免疫性肌炎(EAM)動物模型制作方法?方法 實驗動物選用健康雌性英國短毛豚鼠20只,分為正常組5只?佐劑對照組5只?EAM組10只?正常組不予任何處理;佐劑對照組采用完全弗氏佐劑(CFA)0.25mL加等量PBS;EAM組采用CFA 0.25mL加等體積濃度為10mg/L的兔純化肌球蛋白懸液,分別于0?7?14?21d進行分次皮下注射,并在0?7d同時聯(lián)合腹腔注射百日咳桿菌原液?評價實驗動物的臨床癥狀?血肌酶及病理改變?結(jié)果正常組及佐劑對照組動物的臨床癥狀?血肌酶及病理改變未見異常?EAM組動物血肌酶升高,臨床癥狀與病理改變與人類多發(fā)性肌炎類似,模型成功率為80%?結(jié)論應(yīng)用純化肌球蛋白制作實驗性自身免疫性肌炎動物模型死亡率低,成功率高,為研究人類發(fā)性炎性肌病發(fā)病機理和治療提供較好的工具,肌球蛋白可能是誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的候選成分之一?

實驗性自身免疫性肌炎;肌球蛋白;完全弗氏佐劑;百日咳桿菌

特發(fā)性炎性肌病是一種病因不明的,以累及橫紋肌為主的自身免疫性炎性肌病[1]?實驗性自身免疫性肌炎(experimental autoimmune myositis,EAM)與人類多發(fā)性肌炎和皮肌炎病理改變具有許多共同特點,因此是研究人類炎性肌病發(fā)病機制和探尋新治療方法的有用工具[2]?由于誘發(fā)炎性肌病的自身抗原至今仍不清楚,目前多數(shù)采用異種骨骼肌勻漿免疫動物(如豚鼠?大鼠和小鼠)方法誘發(fā)EAM,但是存在模型成功率低?死亡率高等多種問題?近年來國外有應(yīng)用純化的肌球蛋白誘發(fā)實驗性自身免疫性肌炎的報道[3-4],國內(nèi)尚無此方面研究?作者采用兔純化的肌球蛋白作為抗原免疫豚鼠成功制作了EAM模型,與以往國內(nèi)報道的骨骼肌勻漿免疫動物誘發(fā)的EAM的方法相比,成功率高,死亡率小,同時證實了肌球蛋白可能作為一種抗原參與了多發(fā)性肌炎的發(fā)病機制?

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 選用健康雌性英國短毛豚鼠20只,6～8周齡,體質(zhì)量250～300g,購于中國人民解放軍總醫(yī)院動物實驗室?純化兔肌球蛋白(5mg/0.5mL)?完全弗氏佐劑(complete freund′s adjuvant,CFA)購于sigma公司,百日咳桿菌購于北京天壇生物制品研究所?

1.2 動物模型制作及分組 實驗動物分為3組,正常組?佐劑對照組?EAM組?正常組:動物5只,不給予任何處理;佐劑對照組:動物5只,免疫物為CFA 0.25mL加等量PBS(冰浴下混合充分乳化);EAM組:動物10只,免疫物為CFA 0.25mL加等體積濃度為10mg/L的兔純化肌球蛋白懸液(冰浴下混合充分乳化)?免疫注射部位為背部兩側(cè),均為皮下注射,免疫劑量為每次0.5mL,1次/周,分別于0?7?14?21d各進行1次免疫注射,共4次?佐劑對照組?EAM組所有實驗動物在第1次和第2次免疫注射同時進行百日咳原液腹腔注射,每只0.5 mL,細菌數(shù)目為4×1010個?

1.3 評價指標及方法 每周免疫注射前所有豚鼠均稱重;從第2次免疫注射前開始每周參照韓順昌等[1]的方法進行臨床癥狀評分;在第4次免疫注射后1周行肌肉活檢;而后行心臟取血,測肌酸激酶?從臨床表現(xiàn)?生化和組織病理3個角度進行模型評價?

1.3.1 臨床癥狀評分測定 豚鼠于第4次免疫注射1周后根據(jù)動物體質(zhì)量?姿勢?呼吸及活動情況,參照 Wada等[5]和Matsubara等[6]的方法進行評分?0分:無明顯的肌無力表現(xiàn);1分:無力咬嚙或喊叫;2分:休息時隆起體位,頭下垂,前肢屈曲,行走震顫;3分:嚴重肌無力,不喊叫,體質(zhì)量減輕,甚至肌肉萎縮,呼吸困難,瀕于死亡?(癥狀居中者分別評分為0.5?1.5?2.5分)?

1.3.2 血清CK檢查 豚鼠于第4次免疫注射1周后心臟緩慢取血?低溫2 000轉(zhuǎn)/分,離心7min,取上清,立即冷凍與―80℃冰箱,標本收集完畢后,送往生化科行血清肌酸激酶(CK)檢查(日立全自動生化分析儀)?

1.3.3 病理檢查及組織病理學分析 每只豚鼠于第4次免疫注射后1周取材,將豚鼠麻醉(水合氯醛腹腔注射),取左側(cè)股四頭肌,黃芪膠粉包埋后立即用異戊烷和液氮速凍,低溫恒溫切片機連續(xù)切片,切片厚度為5μm,進行蘇木素-伊紅染色(HE染色),光學纖維鏡觀察?所有組織切片根據(jù)Kojima等[2]描述的方法對組織炎癥浸潤程度進行分級:-未發(fā)現(xiàn)病灶;+:累及1～5肌纖維;++:累及6～30個肌纖維;+++:累及整個肌束;++++:肌纖維廣泛受累超過一個肌束范圍?

1.4 統(tǒng)計學處理 采用美國Graphpad Prism 4軟件分析,各項指標以±s表示,對組間計量資料進行t檢驗,以P0.05為差異有統(tǒng)計學意義?

2 結(jié) 果

2.1 各組豚鼠一般情況比較 正常組豚鼠(n=5)全部存活,進食良好,活動正常,每周重量增長15～40g?佐劑對照組豚鼠(n=5)全部存活,第1～2次免疫注射后局部見0.2～0.5 cm硬結(jié),無局部破潰,進食良好,活動正常,重量每周增長15～40g?EAM組10只豚鼠免疫注射后兩周開始出現(xiàn)背部皮膚紅腫?硬結(jié)或破潰,其中1只豚鼠(8號)活動正常,重量增長緩慢,第4周體質(zhì)量增長10g;其余9只豚鼠第2次免疫注射后出現(xiàn)重量增長緩慢或重量減輕,活動遲緩,進行性加重,7號豚鼠在第3次免疫注射后出現(xiàn)嚴重的肌肉萎縮?呼吸急促?進食費力等癥狀,并于第4次免疫注射后死亡,死亡后行肌肉病理檢查,死亡原因考慮為肌炎導致的呼吸功能衰竭?

2.2 各組豚鼠臨床癥狀評分情況比較 正常組和佐劑對照組豚鼠臨床癥狀評分均為0分,EAM組10只豚鼠臨床癥狀評分見表1?

2.3 各組豚鼠血清CK水平比較 正常組豚鼠血清CK水平為534～696.09IU/L,平均(637.4±62.903)IU/L;佐劑對照組豚鼠血清CK水平為525～701.05IU/L,平均(638.4±57.08)IU/L;EAM組10只豚鼠血清CK水平為見表1?

2.4 各組豚鼠組織病理學分析比較 正常組和佐劑對照組豚鼠肌肉組織HE染色顯示正常?EAM組中8只豚鼠HE染色證實模型成功(模型成功率80%),鏡下可見肌纖維大小不一,肌纖維變性?壞死及吞噬現(xiàn)象,有較多淋巴細胞和巨噬細胞浸潤;EAM組臨床評分正常豚鼠(8號)的肌肉病理檢查正常;EAM組10只豚鼠病理評分見表1?EAM組豚鼠的病理分級與血清CK水平呈正相關(guān)(r=0.9665,P0.01)?

表1 EAM組豚鼠臨床評分?血清CK水平及炎癥浸潤的程度比較

3 討 論

目前國內(nèi)外采用較多的是異種動物骨骼肌勻漿免疫動物方法誘發(fā)EAM,模型的嚴重程度變異大,死亡率較高,應(yīng)用受到限制[3-8]?作者參考 Nemoto等[9]的方法應(yīng)用純化兔肌球蛋白誘發(fā)豚鼠的自身免疫性肌炎模型,其臨床?病理改變與人類的多發(fā)性肌炎相似,成功率高?死亡率低,雖然模型的臨床評分較以往的報道低,但變異性小,是多發(fā)性肌炎非常好的動物模型,可用于多發(fā)性肌炎發(fā)病機制的研究?與Nemoto等[9]不同,作者使用滅活的百日咳桿菌原液代替百日咳毒素作為佐劑,因此模型的成本相對較低?

復習以往國內(nèi)的文獻報道,肌肉勻漿免疫的實驗性肌炎動物模型肌勻漿蛋白濃度是3～6mg/mL,需免疫4～8周時間成模[6-7]?本組采用了純化的肌球蛋白,濃度為10mg/L,模型成功率高達80%,雖然臨床評分主要在1.5～2.0分之間,相對較低,但模型穩(wěn)定,并且發(fā)病早,可較早的篩選動物?同時EAM組肌肉病理改變與人類肌炎相似,表現(xiàn)為肌肉變性壞死及淋巴細胞侵潤,是非常好的多肌炎的動物模型?

本研究發(fā)現(xiàn)EAM組豚鼠的病理分級與血清CK水平呈正相關(guān),說明血清CK水平是反應(yīng)EAM急性期肌肉損傷嚴重程度的客觀指標,在臨床上可用來觀察多肌炎病情變化和進行病情的評估?同時作者發(fā)現(xiàn)EAM組8號豚鼠臨床評分正常,雖然肌肉組織病理正常,但血清CK輕度增高,同時體質(zhì)量增長較正常組少,考慮為多肌炎的早期,同時可能說明血清CK的升高出現(xiàn)在肌肉組織病理改變之前?同樣在臨床上有時會碰到血清CK升高但肌肉病理正常的患者,可能也是因為同樣的原因?

作者選用雌性豚鼠為實驗對象,采用兔純化肌球蛋白加完全弗氏佐劑反復多次免疫豚鼠,成功地制作出EAM動物模型?與以往的多次實驗相同,作者證實單純的CFA并不能造成肌炎模型,表明肌球蛋白在EAM模型中起了決定性的作用,但Kohayama等報道應(yīng)用C蛋白可以在Lewis大鼠誘發(fā)病理改變更為嚴重的肌炎模型?因此,肌球蛋白可能是誘發(fā)自身免疫反應(yīng)的候選成分之一?

[1] 韓順昌,蒲傳強.英夫利昔治療實驗性免疫性肌炎的實驗研究[J].中國神經(jīng)免疫學神經(jīng)病學雜志,2007,14(6):336-339.

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[3] Rosenberg NL,Ringel SP,Kotzin BL.Experimental autoimmune myositis in SJL/J mice[J].Clin Exp Immunol,1987,68(1):117-129.

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[5] Wada J,Shintani N,Kikutani K,et al.Intravenous immunoglobulin prevents experimental autoimmune myositis in SJL mice by reducing anti-myosin antibody and by blocking complement deposition[J].Clin Exp Immunol,2001,124(2):282-289.

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[7] 張寧,肖波,李靜,等.實驗性自身免疫性肌炎中 MMP-2,MMP-9,TIMP-1的表達及甲基強的松龍的影響[J].湖南醫(yī)科大學學報,2003,28(1):5-8.

Experimental autoimmune myositis model induced by pure myosin of rabbit

(,,,100048,)

ObjectiveTo explored the method of experimental autoimmune myositis animal model.MethodsTwenty female guinea pigs were randomly assigned into 3groups.No treatment was given to the animals in normal group(n=5).The animals in the adjuvant control group(n=5)were subcutaneous injected with complete Freund′s adjuvant(CFA)and equal amount of PBS.The animals in experimental autoimmune myositis(EAM)group(n=10)

CFA plus equal volume rabbit purified myosin suspension(10mg/L)in at day 0,7,14,21respectively,combined with intraperitoneal injection of Bordetella pertussis dope(live bacteria count=4.0×1010)at day 0,7.The clinical symptoms of experimental animals,blood creatine kinase(CK)and pathological changes were evaluated.ResultsThe blood CK of the guinea pigs in normal and control group were normal,but abnormal elevated in EAM group.The clinical findings and pathologic changes of the guinea pigs in normal and control group were normal,and in EAM group were similar to the human′s in idiopathic inflammatory myopathy.The model success rate was 80%.ConclusionExperimental autoimmune myositis model induced by pure myosin,which was with low mortality and high success rate,provided better tools for the study of the pathogenesis and treatment in inflammatory myopathy.Myosin might be a probable antigen.

Experimental autoimmune myositis Myosin Complete Freund′s adjuvant Bacillus pertussis

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.18.021

A

1671-8348(2012)18-1843-02

2011-07-25

2011-12-22)

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