李智勇,夏 鷹,陳曉東,羅 漢

(海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)外科 570208)

IGF-1對大鼠缺血?缺氧神經(jīng)元p-JNK及p-P38表達(dá)的影響

李智勇,夏 鷹,陳曉東,羅 漢

(海南省?？谑腥嗣襻t(yī)院神經(jīng)外科 570208)

目的研究胰島素樣生長因子-1(IGF-1)對缺血?缺氧大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用及作用機(jī)制?方法 原代培養(yǎng)新生大鼠腦皮質(zhì)神經(jīng)元,建立缺血?缺氧細(xì)胞模型,觀察IGF-1及IGF-1受體抑制劑(AG1024)對該模型細(xì)胞存活率(MTT試驗)?細(xì)胞凋亡(流式細(xì)胞法)?JNK?P38表達(dá)(Western blot法)和Caspase-3活性(熒光測定法)的影響?結(jié)果IGF-1(HII組)及AG1024(HIIA組)干預(yù)細(xì)胞模型24h后,模型細(xì)胞存活率分別為(77.00±3.80)%?(62.00±4.40)%;凋亡率分別達(dá)到14.58%?24.97%?IGF-1組可明顯抑制p-JNK及p-P38的表達(dá)及Caspase-3的活性?結(jié)論IGF-1對缺血?缺氧神經(jīng)元損傷有一定的保護(hù)作用,并通過調(diào)控p-JNK?p-P38及Caspase-3的表達(dá)抑制缺血?缺氧神經(jīng)元的凋亡?

胰島素樣生長因子Ⅰ;缺氧缺血,腦神經(jīng)元;JNK絲裂原活化蛋白激酶類;半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶

缺 氧?缺 血 性 腦 損 傷 (hypoxia-ischemic brain damage,HIBD)是圍生期新生兒腦損傷的最常見病因,重者可致永久性腦損傷,引起腦性癱瘓?智力低下等嚴(yán)重后遺癥?其發(fā)病機(jī)制至今不明,尚無特效治療,近年研究表明,與HIBD有關(guān)的神經(jīng)元凋亡促進(jìn)了繼發(fā)性腦損傷[1-2]?因此,發(fā)病早期抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡成為HIBD救治的關(guān)鍵?胰島素樣生長因子-1(insulinlike growth factor-1,IGF-1)是一種在體內(nèi)?外均具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子?近年來,IGF-1對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的保護(hù)作用研究取得了一定的進(jìn)展,但I(xiàn)GF-1作為缺血?缺氧腦損傷保護(hù)劑的作用機(jī)制研究尚不充分[3-4]?本實驗以體外原代培養(yǎng)的新生大鼠腦皮層神經(jīng)元建立類缺血?缺氧細(xì)胞模型,研究IGF-I對神經(jīng)元缺血?缺氧損傷的保護(hù)作用,進(jìn)一步探討IGF-1在HIBD病理生理過程中的調(diào)控機(jī)制?

1 材料與方法

1.1 材料 重組人胰島素樣生長因子-1(recombinant human insulin-like growth factor-1,rhIGF-1)購自Sigma公司,胰島素樣生長因子受體抑制劑(AG1024)購自Calbiochem公司,Neurobasal培養(yǎng)基及胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自Invitrogen公司,微管相關(guān)蛋白-2(microtubule associated protein-2,MAP-2)?c-Jun 氨 基 端 激 酶 (c-Jun-NH2-terminal kinase,JNK)?p-JNK?P38?p-P38 抗 體 購 自 Abcam 公 司,ApoAlert Caspase Fluorescent Assay Kit購自BD Biosciences Clontech公司?

1.2 方法

1.2.1 神經(jīng)元缺血?缺氧模型的建立 在無菌條件下,取新生1dSD大鼠的大腦皮質(zhì),用Neurobasal培養(yǎng)基清洗,剪碎并通過40目不銹鋼篩網(wǎng)過篩;將組織塊置于0.25%胰蛋白酶中,振搖,37℃孵育消化10min后加FBS終止消化,過篩,濾液懸浮到Neurobasal培養(yǎng)基中,37℃?1 200r/min離心5min,去上清,清洗2次;沉淀加入含10%FBS的Neurobasal培養(yǎng)基中,輕輕吹打成單細(xì)胞懸液?將細(xì)胞懸液接種到用10μg/mL多聚-L-賴氨酸包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,隔日半量換液一次;培養(yǎng)4d后,換不含10%FBS的Neurobasal培養(yǎng)基,將培養(yǎng)瓶置于低氧培養(yǎng)箱中,氧濃度調(diào)為1%,模擬缺血?缺氧條件培養(yǎng)24h?

1.2.2 實驗分組 將同批培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元隨機(jī)分為4組:(1)對照組(CON):正常培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元;(2)缺氧?缺血組(HI);(3)rhIGF-1干預(yù)組(HII):于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),無血清培養(yǎng)基中添加終濃度為100nmol/L的rhIGF-1,培養(yǎng)24h;(4)rhIGF-1與AG1024干預(yù)組(HIIA):于低氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),無血清培養(yǎng)基中添加終濃度為100nmol/L 的rhIGF-1及10μmol/L的AG1024,培養(yǎng)24h?

1.2.3 免疫組織化學(xué)觀察rhIGF-1對模型細(xì)胞的影響 各組細(xì)胞干預(yù)后,棄培養(yǎng)液,用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)洗滌3次,4%多聚甲醛固定后進(jìn)行 MAP-2免疫熒光染色?

1.2.4 rhIGF-1對模型細(xì)胞活性的影響 細(xì)胞以5×105/mL轉(zhuǎn)入96孔板,進(jìn)入對數(shù)生長期后更換培養(yǎng)液,按實驗分組加入干預(yù)因素,孵育24h后,加入10μL甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)(5mg/mL PBS貯存液),孵育4h,吸棄培養(yǎng)液,加入200μL二甲基亞砜,待顆粒溶解后放在酶標(biāo)儀上,在490nm波長處檢測各孔的吸光度?

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析 采用預(yù)冷PBS沖洗留取細(xì)胞2次,重懸細(xì)胞使細(xì)胞密度為1×106/L,取100μL細(xì)胞懸液,加入5μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的AnnexinⅤ和10μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)混勻,室溫下避光孵育15min,每管內(nèi)加入400μL結(jié)合緩沖液(1×),于1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞分析?激發(fā)波長為488nm,計數(shù)104個細(xì)胞?所有數(shù)據(jù)均經(jīng)Cell Qust軟件收集處理?

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法(Western blotting)檢測 取各組細(xì)胞,棄培養(yǎng)液,用預(yù)冷的PBS清洗3次,100mm平皿加200μL或300μL細(xì)胞裂解液,冰面上裂解20min,15 000r/min,4℃離心10min,取上清液,Bradford法進(jìn)行蛋白定量(Bio Radproteinassay)?以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,半干電轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,室溫下用封閉液封閉2h后加入一抗(JNK?p-JNK?P38?p-P38抗體),1∶1 000稀釋,4℃孵育過夜,抗兔IgG二抗(1∶1 000稀釋)反應(yīng)2h,化學(xué)發(fā)光法顯色,X射線底片曝光?實驗重復(fù)3次,β-actin作為內(nèi)參照?

1.2.7 Caspase-3蛋白活性檢測 分組收集細(xì)胞(2×106);用預(yù)冷的PBS洗2次后,加入Caspase-3裂解液,冰浴10min后,4℃離心(12 000r/min,10min);取上清液,用考馬斯亮藍(lán)法(Bradford法)檢測上清液中的蛋白質(zhì)濃度;50μL Caspase底物于37℃?避光孵育4h;用酶標(biāo)儀在405nm波長處檢測吸光度?

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以±s表示,應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析,組間比較采用單向方差分析法檢驗,P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義?

2 結(jié) 果

2.1 顯微鏡下觀察各干預(yù)組細(xì)胞生長狀態(tài) 見封3圖1?鏡下觀察發(fā)現(xiàn)HI組?HII組及HIIA組細(xì)胞數(shù)量較正常組明顯減少?HI組與HIIA組細(xì)胞數(shù)量比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?HII組的細(xì)胞數(shù)量高于 HI組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)?

2.2 rhIGF-1對模型細(xì)胞活性的影響 采用 MTT比色法檢測rhIGF-1對模型細(xì)胞活性的影響,rhIGF-1對模型細(xì)胞有保護(hù)作用,細(xì)胞存活率明顯升高?HI組細(xì)胞活性明顯下降,存活率為(67.83±5.28)%?使用IGF-1干預(yù)模型細(xì)胞24h后,HII組細(xì)胞的存活率達(dá)到(77.00±3.80)%?HIIA組細(xì)胞存活率為(62.00±4.40)%?實驗結(jié)果均重復(fù)6次,見圖2?

圖2 rhIGF-1對模型細(xì)胞活性的影響

2.3 rhIGF-1對模型細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用 采用FITC-AnnexinⅤ與PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)檢測,實驗結(jié)果顯示,HI組細(xì)胞的凋亡率為27.10%(圖3B);HII組凋亡率為14.58%(圖3C);HIIA組凋亡率為24.97%(圖3D)?流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示,RHIGF-1對模型細(xì)胞有保護(hù)作用,能夠降低HI組細(xì)胞的凋亡率?

2.4 rhIGF-1對模型細(xì)胞JNK和P38表達(dá)的影響 本實驗采用Western blotting檢測了JNK和P38表達(dá)?結(jié)果發(fā)現(xiàn),在HI組中,p-JNK 和 p-P38表 達(dá) 上 調(diào)?HII組 p-JNK 和 p-P38表達(dá)受到抑制?實驗均重復(fù)3次(見圖4)?

圖3 rhIGF-1對模型細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用

圖4 rhIGF-1對模型細(xì)胞JNK和P38表達(dá)的影響

2.5 rhIGF-1對Caspase-3蛋白活性的影響 實驗結(jié)果顯示,與正常組相比較,HI組和 HIIA組Caspase-3活性達(dá)到(210.86±15.00)%?(203.32±34.00)%,HII組 Caspase-3活性受到抑制,結(jié)果差異具有統(tǒng)計學(xué)意義?實驗結(jié)果均重復(fù)6次(見圖4)?

圖5 rhIGF-1對Caspase-3蛋白活性的影響

3 討 論

近年來,實驗研究認(rèn)為IGF-1對神經(jīng)元缺血?缺氧具有一定的保護(hù)作用,但作用機(jī)制還未完全明確?通過MTT及免疫組化觀察發(fā)現(xiàn)IGF-1可增加缺血?缺氧神經(jīng)元的存活率,顯現(xiàn)出明確的神經(jīng)保護(hù)作用,這也與他人的研究結(jié)果相一致[5]?IGF-1是一種有效的神經(jīng)保護(hù)劑,在成熟腦組織中有廣泛的低水平表達(dá),它可以調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的生長和分化,抑制細(xì)胞凋亡,對細(xì)胞受損后的恢復(fù)也有重要作用[6]?流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)外源性給予IGF-1,可以有效抑制缺血?缺氧神經(jīng)元的凋亡率,并且 Western blotting檢測證實與下調(diào)p-JNK?p-P38的表達(dá)及抑制Caspase-3的活性有關(guān)?AG1024是IGF-1受體抑制劑,可以明顯抑制IGF-1對缺血?缺氧神經(jīng)元的保護(hù)作用,證實了IGF-1的神經(jīng)保護(hù)作用,且該保護(hù)作用與調(diào)節(jié)JNK?P38信號途徑有關(guān)?

絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase,MAPK)是一類由脯氨酸介導(dǎo)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,通過Ⅷ區(qū)域雙位點的磷酸化而活化,MAPK超家族包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinases,ERKs)?p38 MAPK(p38mitogen activated protein kinase)?JNK 和應(yīng)激活化蛋白激酶(stress activated protein kinases,SAPKs)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?缺血?缺氧腦損傷可通過一系列信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核,啟動相關(guān)基因表達(dá),引起神經(jīng)元凋亡?有研究表明,缺血?缺氧腦損傷可激活JNK?p38信號途徑[7]?在本實驗中,發(fā)現(xiàn)缺血?缺氧細(xì)胞模型中,p-JNK與p38水平升高,IGF-1對其有抑制作用?同樣,在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制中,Caspase家族起著關(guān)鍵作用,它是一組在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用的酶?Caspase為半胱氨酸天門冬氨酸蛋白,是一組具有相似的氨基酸順序和二級結(jié)構(gòu)的半胱氨酸蛋白酶,與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān),還參與細(xì)胞因子的成熟?細(xì)胞生長和分化?在Caspase家族成員中,Caspase-3對凋亡的進(jìn)程起著決定性作用[8]?Caspase-3被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者,是蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?本次研究發(fā)現(xiàn),缺血?缺氧細(xì)胞模型中Caspase-3的活性升高,說明Caspase-3參與了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡,給予IGF-1后,Caspase-3的活性有明顯改變?其可能的機(jī)制是,缺血?缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元增加了p-JNK與p38的表達(dá),從而啟動內(nèi)源性途徑激活Caspase家族,致使Caspase-3活性增高,最終神經(jīng)元凋亡發(fā)生,而IGF-1可干預(yù)該途徑,最終達(dá)到抑制神經(jīng)元凋亡的作用?

綜上所述,盡管IGF-1抑制神經(jīng)元凋亡的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡釋清楚,可能還存在許多未知的信號途徑和調(diào)控基因在發(fā)揮作用,但隨著對IGF-1與細(xì)胞凋亡研究的不斷深入,IGF-1有可能被作為靶點為HIBD的治療開辟新的途徑?

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Influence of IGF-1 on p-JNK,p-P38 in hypoxia ischemia neurons of rat

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(,,,570208,)

ObjectiveTo investigate the anti-apoptosis protective effects of insulin-like growth factor-1(IGF-1)on hypoxia ischemia neurons of rats and its action mechanism.MethodsCortical neurons were cultured,and made hypoxia ischemia cell model.Hypoxia ischemia cells were incubated with IGF-1or AG1024to study cell viability(MTT),apoptosis(Flow cytometry),JNK and P38expression(Western blot),and Caspase-3activation(fluorometric method).ResultsHypoxia ischemia cells were exposed to IGF-1or AG1024for 24h,and MTT assay showed that the cell survival rates of IGF-1(HII group)and AG1024(HIIA group)were(77.00±3.80)%and(62.00±4.40)%,respectively.The percentage of apoptotic cells was 14.58%and 24.97%,respectively.The expression of p-JNK,p-P38and Caspase-3activation were inhibited by IGF-1.ConclusionIGF-1protects neurons against hypoxia ischemia cells injure by inhibiting the expression of p-JNK,p-P38and caspase-3activation.

insulin-like growth factorⅠ;hypoxia-ischemia,brain;neurons;JNK mitogen-activated protein kinases;caspases

10.3969/j.issn.1671-8348.2012.16.005

A

1671-8348(2012)16-1572-03

2011-10-06

2011-12-20)

?基礎(chǔ)研究?