馮發(fā)青，王恩源，伍慶，龍風榮，柳立偉，洪江

(1.貴州師范大學，貴州貴陽550001;2.貴州弘康藥業(yè)有限公司，貴州貴陽550001;3.貴州科學院，貴州貴陽550001)

麥味地黃膠囊處方出自明代經(jīng)典醫(yī)籍《體仁匯編》，是在麥味地黃丸基礎(chǔ)上進行改劑而成。其方中山茱萸具有補益肝腎，澀精固脫之功效，馬錢苷為其主要有效成分之一，牡丹皮具有清熱涼血，活血化瘀的功效，主要有效成分為丹皮酚和芍藥苷［1］?！吨袊幍洹?010年版一部以馬錢苷和丹皮酚為麥味地黃丸的質(zhì)量控制指標［2］，前人也對此類中成藥中馬錢苷或丹皮酚的含有量測定方法進行了研究［3-7］，但對方中芍藥苷含有量測定方法研究較少。本實驗選擇馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚為研究對象，在參照文獻基礎(chǔ)上［8-13］，建立了一種同時測定麥味地黃膠囊中馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的方法，該方法準確可靠，為更好地控制麥味地黃膠囊成品質(zhì)量提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent色譜工作站(安捷倫科技有限公司);CH—250超聲波清洗儀(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所);AL—204電子天平［梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司］。

1.2 試藥馬錢苷對照品(批號111640-200604)、芍藥苷對照品(批號110736-200629);丹皮酚對照品(批號110708-200506)為中國藥品生物制品檢定所提供;麥味地黃膠囊為市售(批號:20111101，20111201，20111202，貴州弘康藥業(yè)有限公司);缺山茱萸、牡丹皮陰性樣品(自制);乙腈為色譜純，水為超純水(自制)，其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Diamonsil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0～28 min，8%A～19%A;28～38 min，19%A～26%A;38～65 min，26%A～50%A);體積流量:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:235 nm。進樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚對照品適量，加甲醇適量溶解并定量稀釋制成含馬錢苷0.522 1 mg/mL、芍藥苷0.453 8 mg/mL和丹皮酚1.029 mg/mL的混合對照品貯備液，備用。精密吸取上述貯備液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇定容，制得含馬錢苷52.21 μg/mL、芍藥苷45.38 μg/mL和丹皮酚0.102 9 mg/mL的混合對照品溶液。供定量測定用。

2.2.2 供試品溶液的制備取麥味地黃膠囊內(nèi)容物約1.0 g，精密稱定，至具塞錐形瓶中，加50%甲醇20.00 mL，密塞，稱定質(zhì)量;超聲提取1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，常壓過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 陰性供試品溶液的制備按處方比例分別制備缺山茱萸、牡丹皮藥材的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備陰性供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液分別注入高效液相色譜儀，按2.1項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的理論塔板數(shù)均不低于10 000，各峰分離度均達1.5，且陰性對照無干擾。對照品、樣品與陰性樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對照品(A)、樣品(B)、缺牡丹皮陰性樣品(C)、缺山茱萸陰性樣品(D)高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances(A)，sam ple(B)，negative samp le w ithout Corni Fructus(C)and negative samp le w ithout Moutan Cortex(D)

2.4 線性關(guān)系的考察分別精密量取上述混合對照品貯備液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準溶液。按2.1項下色譜條件分別進樣10 μL，記錄色譜圖。以各對照品峰面積(Y)為縱坐標，進樣量(X，μg)為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程分別為:馬錢苷Y=1 254.3X+49.359(r=0.999 8)，芍藥苷Y=1 585.7X+17.172(r=0.999 7)，丹皮酚Y=3 447.2X－73.445(r=0.999 9)，結(jié)果表明馬錢苷在0.209～1.253 μg，芍藥苷在0.182～1.089 μg，丹皮酚在0.412～2.470 μg范圍內(nèi)，其含有量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗精密吸取同一混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件重復進樣6次，按峰面積計算RSD值。馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚的RSD分別為0.4%、0.5%和0.3%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。2.6穩(wěn)定性試驗取批號為20111201樣品，按2.2.2項下制備供試品溶液，室溫放置，按2.1項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、10 h進樣測定，記錄色譜峰面積，結(jié)果馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚峰面積RSD分別為0.2%、1.1%和0.3%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復性試驗取批號為20111201樣品，按2.2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件進行測定，計算得馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚質(zhì)量分數(shù)的RSD分別為1.1%、1.2%和0.5%，表明該方法重復性好。

2.8 回收率試驗取批號為20111201麥味地黃膠囊內(nèi)容物9份(3份1組)，每份約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，各組分別按樣品中各成分量的80%、100%、120%加入對照品，按2.2.2項下的方法操作制備供試品溶液，按2.1項下方法進行測定，計算回收率。結(jié)果馬錢苷、芍藥苷、丹皮酚的平均回收率分別為98.22%、97.88%、99.10%，RSD分別為1.14%、0.90%、1.37%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab.1 Results of recovery(n=9)

2.9 樣品測定取3批樣品(批號20111101、20111201、20111202)，每批3份，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件對3批樣品進行測定，記錄峰面積，外標法計算，測定結(jié)果見表2。

表2 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Content determ ination of samp les(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇經(jīng)紫外可見分光光度計掃描，馬錢苷在235 nm處有最大吸收峰，芍藥苷在230 nm處有最大吸收峰，丹皮酚在230 nm、274 nm處均有吸收峰。通過實驗考察在波長為235 nm時馬錢苷、芍藥苷和丹皮酚均有較好的響應，所以本實驗選擇檢測波長為235 nm。

3.2 流動相的選擇《中國藥典》2010年版一部中麥味地黃丸有關(guān)馬錢苷的測定以含有四氫呋喃為流動相，而四氫呋喃對反相色譜系統(tǒng)的柱塞密封圈有一定的腐蝕性，故本實驗考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相體系。發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸水溶液流動相體系中進行梯度洗脫時，其分離度、理論塔板數(shù)、峰的對稱性及出峰時間均達到滿意的結(jié)果，且可與芍藥苷、丹皮酚在同一流動相體系中進行同時測定。

3.3 提取溶劑和方法的選擇由于芍藥苷、馬錢苷易溶于水，丹皮酚易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，故實驗比較了甲醇，乙醇，及80%、50%、20%甲醇5種提取溶劑，并考察了超聲和加熱回流兩種提取方法，以及提取時間和溶劑體積等，試驗結(jié)果表明加入20 mL 50%甲醇溶液超聲提取1 h的條件下各指標成分提取完全、方法簡便，提取效果較好。

3.4 結(jié)論通過提取條件的優(yōu)化、色譜條件的選擇及系統(tǒng)性試驗的考察，說明該方法快速，結(jié)果準確可靠，可以為提高麥味地黃膠囊的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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