張文娓，閆麗莉，陳忠新

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

防己茯苓湯一方出自東漢張仲景所著的《金匱要略》，其組成是防己、茯苓、黃芪、甘草、桂枝5味藥，用于益氣健脾、溫陽利水，主治皮水?，F(xiàn)代臨床主要治療慢性腎炎水腫、心臟病水腫等多種脾虛引起的水腫。防己茯苓湯煎膏劑在原方基礎(chǔ)改良劑型，為了保證防己茯苓湯煎膏劑的質(zhì)量穩(wěn)定、可控，本研究參考中國藥典［1］及相關(guān)資料，對制劑中的黃芪、防己和甘草采用TLC法進行定性鑒別，對其主要成分粉防己堿和防己諾林堿采用HPLC法進行含量測定，為防己茯苓湯煎膏劑質(zhì)量標準的建立提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

高效液相色譜儀(Waters1515型，美國Waters公司);紫外檢測器(Waters 2487型，美國Waters公司);紫外線分析儀(ZF－I型，上海顧村電光儀器廠);超聲波清洗機(BL3－120C，上海比朗儀器有限公司)。

1．2 試藥

對照品黃芪甲苷(批號 0781－200512);粉防己(批號 0711—200316);防己諾林堿(批號 0793－200304);防己、甘草對照藥材(中國藥品生物制品檢

作者簡介:張文娓(1982－)，女，實驗師，主要從事中藥藥劑研究。

收稿日期:2012－07－18

修回日期:2012－08－25

定所);防己茯苓湯煎膏劑(實驗室自制，批號20100601、20100602、20100603);硅膠 G 薄層板(青島海洋化工廠);甲醇(色譜純，美國迪馬公司);甲醇、二乙胺等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 TCL鑒別方法的建立

2．1．1 防己

精密稱取對照品粉防己堿，防己諾林堿，加甲醇制成1mg/ml的混合溶液，作為對照品溶液。取本品10ml，加氨水調(diào)節(jié)pH至11，再加三氯甲烷20ml，取三氯甲烷層，共3次，合并，蒸干，殘渣加甲醇溶解至1ml，得供試品液。另取防己對照藥材1g，加15ml95%乙醇，加熱回流1h，放冷，濾過，蒸干濾液，得殘渣加甲醇溶解至2ml，得對照藥材溶液。取按制備工藝制成不含防己的陰性樣品同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述溶液各5μl，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷－甲醇 －丙酮(6∶1∶1)，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果供試品色譜中，在與對照品及對照藥材相應(yīng)的位置上，日光下均呈現(xiàn)出兩個橙色斑點，由下到上依次為防己諾林堿、粉防己堿，而陰性樣品在此處無斑點。

2．1．2 黃芪

取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成1mg/ml的溶液，作為對照品溶液。另取本品10ml，加入水飽和的正丁醇20ml萃取，取正丁醇層，共3次，合并，加氨試液洗滌2次，每次20ml，再用正丁醇飽和的水20ml萃取2次，合并，蒸干，殘渣加甲醇溶解至1ml，中性氧化鋁柱除雜，收集50%乙醇洗脫液50ml，蒸干，殘渣加甲醇1ml使溶解，得供試品溶液。取按制備工藝制成不含黃芪的陰性樣品，同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述溶液各5μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為三氯甲烷－甲醇－水(13∶7∶2)的下層溶液，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果，供試品色譜中，在與黃芪甲苷對照品相應(yīng)的位置上，日光下顯棕褐色斑點，而陰性樣品在相同位置無斑點。

2．1．3 甘草

取甘草對照藥材2g，加乙醇25ml，超聲20min，過濾，取濾液，蒸干，殘渣加甲醇溶解至2ml，得對照藥材溶液;另取本品10ml，加水飽和正丁醇20ml萃取2次，取正丁醇層，合并，用正丁醇飽和水10ml洗2次，取正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解至1ml，得供試品溶液;取按制備工藝制成不含甘草的陰性樣品，同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述供試品、陰性供試品溶液各4～7μl及對照藥材溶液2μl，點于同一硅膠G薄層板上，展開劑為乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水(15∶1∶1∶1)，展開，取出，晾干，在日光和紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與甘草對照藥材相應(yīng)的位置上，日光下顯黃色斑點，紫外光燈(365nm)下顯藍色熒光斑點，而陰性樣品在相同位置無斑點。

2．2 含量測定方法的建立

2．2．1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend ODS反相柱(4．6mm×250mm，5μm);檢測波長 282nm;柱溫:室溫;流動相:甲醇∶0．6% 二乙胺(74∶26);流速 1．0mL/min;進樣量10μL;色譜圖見圖1。

圖1 粉防已堿、防己諾林堿對照品、樣品及陰性對照品HPLC色譜圖a．粉防己堿、防己諾林堿對照品;b．樣品;c．陰性對照品

2．2．2 對照品溶液的制備

精密稱定粉防己堿對照品、防己諾林堿對照品，加甲醇溶解制得對照品溶液，濃度為每1ml分別含粉防己堿 0．06mg、防己諾林堿 0．03mg。

2．2．3 供試品溶液的制備

精密吸取樣品 5ml，置分液漏斗中，加氨水0.5mL，三氯甲烷10ml萃取，合并三氯甲烷溶液，蒸干，殘渣加甲醇溶解至25ml，得供試品溶液。

2．2．4 陰性對照液的制備

取除防己外的其他處方量藥材，按制備工藝方法制備防己陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制成防己陰性對照溶液。

2．2．5 線性關(guān)系考察

分別精密稱取粉防己堿對照品2．59mg、防己諾林堿對照品1．53mg，加甲醇溶解至25ml。精密吸取對照片溶液 1．0ml，2．0ml，3．0ml，4．0ml，5．0ml分別置于5ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液10μl注入液相色譜儀中，測定峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，粉防己堿線性回歸方程為 Y=5 804.7X+26 546，r=0.999 1，線性范圍為 20．72 ～103．50μg/mL;防己諾林堿回歸方程 Y=6 810．5X+7 472．3，r=0．999 2，線性范圍為12．24 ～61．20μg/mL。

2．2．6 精密度實驗

精密吸取10ul供試品溶液，連續(xù)進樣6次，測定粉防己堿和防己諾林堿的峰面積的RSD分別為1.01%，1．09%。

2．2．7 穩(wěn)定性實驗

分別精密吸取供試品溶液 10μl，于 0h、2h、4h、6h、8h、10h進樣，10h內(nèi)測定粉防己堿和防己諾林堿峰面積積分值的RSD分別為1．640%，1．49%。

2．2．8 重復(fù)性實驗

取同一批樣品6份，按供試品溶液制備項下方法分別制備樣品溶液，進行含量測定，測定結(jié)果:粉防己堿和防己諾林堿峰面積的RSD值分別為1.71%，1.60%。

2．2．9 回收率實驗

精密量取樣品共6份，分別加入一定量的粉防己堿和防己諾林堿對照品，按樣品含量測定方法測定，計算回收率。結(jié)果見表1，2。

表1 粉防己堿加樣回收率

表2 防己諾林堿加樣回收率

2．2．10 樣品測定

取樣品3批，按供試品溶液制備方法制備，精密吸取10μl樣品溶液進樣，測定含量結(jié)果見表3。

表3 樣品中防己生物堿含量

經(jīng)測定計算，制定防己茯苓湯煎膏劑中每1ml含生物堿不得少于1．8mg。

3 討論

含量測定是質(zhì)量控制中最能有效地考察制劑內(nèi)在質(zhì)量的項目，也是制劑穩(wěn)定性考察最重要的依據(jù)。防己為方中的君藥之一，在本制劑的臨床療效中起著重要作用，故選用防己中的有效成分粉防己堿和防己諾林堿進行測定，具有一定的代表性，建立了防己茯苓湯煎膏劑的含量測定方法，方法簡便，靈敏度高，重復(fù)性好，無干擾。因此以這兩種成分含量測定控制防己茯苓湯煎膏劑的質(zhì)量。

對防己茯苓湯煎膏劑中黃芪、防己和甘草進行TLC鑒別，結(jié)果斑點集中，層次清晰，重現(xiàn)性好，無空白干擾，具有可操作性，可作為防己茯苓湯煎膏劑的定性鑒別方法。

［1］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［S］．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:52，109，141，212．