張文娓,閆麗莉,陳忠新
(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)
防己茯苓湯一方出自東漢張仲景所著的《金匱要略》,其組成是防己、茯苓、黃芪、甘草、桂枝5味藥,用于益氣健脾、溫陽利水,主治皮水?,F(xiàn)代臨床主要治療慢性腎炎水腫、心臟病水腫等多種脾虛引起的水腫。防己茯苓湯煎膏劑在原方基礎(chǔ)改良劑型,為了保證防己茯苓湯煎膏劑的質(zhì)量穩(wěn)定、可控,本研究參考中國藥典[1]及相關(guān)資料,對制劑中的黃芪、防己和甘草采用TLC法進行定性鑒別,對其主要成分粉防己堿和防己諾林堿采用HPLC法進行含量測定,為防己茯苓湯煎膏劑質(zhì)量標準的建立提供實驗依據(jù)。
高效液相色譜儀(Waters1515型,美國Waters公司);紫外檢測器(Waters 2487型,美國Waters公司);紫外線分析儀(ZF-I型,上海顧村電光儀器廠);超聲波清洗機(BL3-120C,上海比朗儀器有限公司)。
對照品黃芪甲苷(批號 0781-200512);粉防己(批號 0711—200316);防己諾林堿(批號 0793-200304);防己、甘草對照藥材(中國藥品生物制品檢
作者簡介:張文娓(1982-),女,實驗師,主要從事中藥藥劑研究。
收稿日期:2012-07-18
修回日期:2012-08-25
定所);防己茯苓湯煎膏劑(實驗室自制,批號20100601、20100602、20100603);硅膠 G 薄層板(青島海洋化工廠);甲醇(色譜純,美國迪馬公司);甲醇、二乙胺等均為分析純。
2.1.1 防己
精密稱取對照品粉防己堿,防己諾林堿,加甲醇制成1mg/ml的混合溶液,作為對照品溶液。取本品10ml,加氨水調(diào)節(jié)pH至11,再加三氯甲烷20ml,取三氯甲烷層,共3次,合并,蒸干,殘渣加甲醇溶解至1ml,得供試品液。另取防己對照藥材1g,加15ml95%乙醇,加熱回流1h,放冷,濾過,蒸干濾液,得殘渣加甲醇溶解至2ml,得對照藥材溶液。取按制備工藝制成不含防己的陰性樣品同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述溶液各5μl,點于同一硅膠G薄層板上,展開劑為三氯甲烷-甲醇 -丙酮(6∶1∶1),展開,取出,晾干,噴以稀碘化鉍鉀試液。結(jié)果供試品色譜中,在與對照品及對照藥材相應(yīng)的位置上,日光下均呈現(xiàn)出兩個橙色斑點,由下到上依次為防己諾林堿、粉防己堿,而陰性樣品在此處無斑點。
2.1.2 黃芪
取黃芪甲苷對照品,加甲醇制成1mg/ml的溶液,作為對照品溶液。另取本品10ml,加入水飽和的正丁醇20ml萃取,取正丁醇層,共3次,合并,加氨試液洗滌2次,每次20ml,再用正丁醇飽和的水20ml萃取2次,合并,蒸干,殘渣加甲醇溶解至1ml,中性氧化鋁柱除雜,收集50%乙醇洗脫液50ml,蒸干,殘渣加甲醇1ml使溶解,得供試品溶液。取按制備工藝制成不含黃芪的陰性樣品,同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述溶液各5μl,分別點于同一硅膠G薄層板上,展開劑為三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)的下層溶液,展開,取出,晾干,噴以10%硫酸乙醇溶液,加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果,供試品色譜中,在與黃芪甲苷對照品相應(yīng)的位置上,日光下顯棕褐色斑點,而陰性樣品在相同位置無斑點。
2.1.3 甘草
取甘草對照藥材2g,加乙醇25ml,超聲20min,過濾,取濾液,蒸干,殘渣加甲醇溶解至2ml,得對照藥材溶液;另取本品10ml,加水飽和正丁醇20ml萃取2次,取正丁醇層,合并,用正丁醇飽和水10ml洗2次,取正丁醇液蒸干,殘渣加甲醇溶解至1ml,得供試品溶液;取按制備工藝制成不含甘草的陰性樣品,同法制成陰性供試品溶液。分別吸取上述供試品、陰性供試品溶液各4~7μl及對照藥材溶液2μl,點于同一硅膠G薄層板上,展開劑為乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶1),展開,取出,晾干,在日光和紫外光燈(365nm)下檢視。結(jié)果,供試品色譜中,在與甘草對照藥材相應(yīng)的位置上,日光下顯黃色斑點,紫外光燈(365nm)下顯藍色熒光斑點,而陰性樣品在相同位置無斑點。
2.2.1 色譜條件
色譜柱:Agilent Extend ODS反相柱(4.6mm×250mm,5μm);檢測波長 282nm;柱溫:室溫;流動相:甲醇∶0.6% 二乙胺(74∶26);流速 1.0mL/min;進樣量10μL;色譜圖見圖1。
圖1 粉防已堿、防己諾林堿對照品、樣品及陰性對照品HPLC色譜圖a.粉防己堿、防己諾林堿對照品;b.樣品;c.陰性對照品
2.2.2 對照品溶液的制備
精密稱定粉防己堿對照品、防己諾林堿對照品,加甲醇溶解制得對照品溶液,濃度為每1ml分別含粉防己堿 0.06mg、防己諾林堿 0.03mg。
2.2.3 供試品溶液的制備
精密吸取樣品 5ml,置分液漏斗中,加氨水0.5mL,三氯甲烷10ml萃取,合并三氯甲烷溶液,蒸干,殘渣加甲醇溶解至25ml,得供試品溶液。
2.2.4 陰性對照液的制備
取除防己外的其他處方量藥材,按制備工藝方法制備防己陰性對照樣品,按上述供試品溶液制備方法制成防己陰性對照溶液。
2.2.5 線性關(guān)系考察
分別精密稱取粉防己堿對照品2.59mg、防己諾林堿對照品1.53mg,加甲醇溶解至25ml。精密吸取對照片溶液 1.0ml,2.0ml,3.0ml,4.0ml,5.0ml分別置于5ml量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻。精密吸取上述溶液10μl注入液相色譜儀中,測定峰面積,以進樣量(μg)為橫坐標,峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,粉防己堿線性回歸方程為 Y=5 804.7X+26 546,r=0.999 1,線性范圍為 20.72 ~103.50μg/mL;防己諾林堿回歸方程 Y=6 810.5X+7 472.3,r=0.999 2,線性范圍為12.24 ~61.20μg/mL。
2.2.6 精密度實驗
精密吸取10ul供試品溶液,連續(xù)進樣6次,測定粉防己堿和防己諾林堿的峰面積的RSD分別為1.01%,1.09%。
2.2.7 穩(wěn)定性實驗
分別精密吸取供試品溶液 10μl,于 0h、2h、4h、6h、8h、10h進樣,10h內(nèi)測定粉防己堿和防己諾林堿峰面積積分值的RSD分別為1.640%,1.49%。
2.2.8 重復(fù)性實驗
取同一批樣品6份,按供試品溶液制備項下方法分別制備樣品溶液,進行含量測定,測定結(jié)果:粉防己堿和防己諾林堿峰面積的RSD值分別為1.71%,1.60%。
2.2.9 回收率實驗
精密量取樣品共6份,分別加入一定量的粉防己堿和防己諾林堿對照品,按樣品含量測定方法測定,計算回收率。結(jié)果見表1,2。
表1 粉防己堿加樣回收率
表2 防己諾林堿加樣回收率
2.2.10 樣品測定
取樣品3批,按供試品溶液制備方法制備,精密吸取10μl樣品溶液進樣,測定含量結(jié)果見表3。
表3 樣品中防己生物堿含量
經(jīng)測定計算,制定防己茯苓湯煎膏劑中每1ml含生物堿不得少于1.8mg。
含量測定是質(zhì)量控制中最能有效地考察制劑內(nèi)在質(zhì)量的項目,也是制劑穩(wěn)定性考察最重要的依據(jù)。防己為方中的君藥之一,在本制劑的臨床療效中起著重要作用,故選用防己中的有效成分粉防己堿和防己諾林堿進行測定,具有一定的代表性,建立了防己茯苓湯煎膏劑的含量測定方法,方法簡便,靈敏度高,重復(fù)性好,無干擾。因此以這兩種成分含量測定控制防己茯苓湯煎膏劑的質(zhì)量。
對防己茯苓湯煎膏劑中黃芪、防己和甘草進行TLC鑒別,結(jié)果斑點集中,層次清晰,重現(xiàn)性好,無空白干擾,具有可操作性,可作為防己茯苓湯煎膏劑的定性鑒別方法。
[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005:52,109,141,212.