王興，張秀榮，張鴻婷，陳會(huì)君，郭丹丹

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

RA是免疫介導(dǎo)的炎癥性疾病，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失調(diào)與RA發(fā)病及病程進(jìn)展密切相關(guān)。腫瘤壞死因子－a(TNF－a)具有許多復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，是免疫反應(yīng)、組織損傷及炎癥的主要介質(zhì)之一，在RA的發(fā)病機(jī)制中占主要地位。RA的發(fā)病的病理基礎(chǔ)為滑膜細(xì)胞的增生、血管翳的形成及骨質(zhì)的破壞，TNF－a與其密切相關(guān)并起“中心罪犯”作用。IL－10是細(xì)胞因子合成的抑制因子。IL－10具有抑制中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等產(chǎn)生細(xì)胞因子的作用，還能降低血清及關(guān)節(jié)液內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量，改善佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)大鼠的病情，明顯抑制免疫細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。本課題以AA大鼠為研究對(duì)象，研究細(xì)胞因子TNF－a，IL－10在佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜中表達(dá)的變化，以探討上述細(xì)胞因子在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病過程的作用，為闡明調(diào)督通脈針灸法治療RA的機(jī)制作初步探討，為針灸治療RA提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar大鼠，60只，體質(zhì)量(200±10)g，潔凈級(jí)，雌雄各半，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性馴養(yǎng)1周，動(dòng)物房濕度、溫度分別維持在70%、20℃左右。

1．2 主要儀器

BACKMAN DU－640型蛋白質(zhì)核酸分析儀(美國(guó));EPPERFOR2002型梯度PCR儀(德國(guó));SIMF124型落地式碎化冰塊制冰機(jī)(日本三洋);低溫冰箱MDF－USOV型(日本三洋);超凈工作臺(tái)(杭州);生物顯微鏡OLYMPUS BX60(日本OLYMPUS公司);數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)安萊公司);DJA多功能艾灸儀(北方中醫(yī)器械廠)。

1．3 主要試劑

RT－PCR試劑盒(美國(guó)Promega公司);二乙基焦碳酸酷(美國(guó) Promega公司);PCR Marke(美國(guó) Promega公司);Trizol RNA提取試劑(美國(guó)Invitrogen公司);PCR Marke(美國(guó) Promega公司);Taq酶(美國(guó)Promega公司);lO×bufev(原平皓生物技術(shù)公司);完全弗氏佐劑(美國(guó)Sigma公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 AA大鼠模型制作

將Wistar大鼠60只適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，先隨機(jī)抽取10只，右后足跖底部常規(guī)皮膚消毒后，用微量注射器于右側(cè)后肢足墊皮內(nèi)注射0.1ml生理鹽水，余50只大鼠足跖底部常規(guī)皮膚消毒后，用微量注射器于右側(cè)后肢足墊皮內(nèi)注射0.1ml完全弗氏佐劑［1－2］。將注射生理鹽水的10只大鼠作為空白對(duì)照組(A組)，將注射CFA后第12天時(shí)出現(xiàn)繼發(fā)反應(yīng)明顯的大鼠選擇30只，隨機(jī)分成模型對(duì)照組(B組)、普通針灸組(C組)、調(diào)督通脈針灸組(D組)，每組10只，接受相應(yīng)處理與治療。

2．2 方法

A組和B組:實(shí)驗(yàn)開始后與針灸治療組在同樣的時(shí)間，用同樣的方法固定，不做任何治療;C組:將大鼠固定，參照《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》選取雙側(cè)腎俞穴之間，用多功能艾灸儀灸療，同時(shí)用0.28mm×25mm毫針針刺雙側(cè)足三里，每日1次，每次15min，治療中間行針1次，采用平補(bǔ)平瀉法，共治療14天;D組:與C組同樣的方法固定，用相同規(guī)格的毫針依次平刺腰陽(yáng)關(guān)、命門、大椎、百會(huì)、足三里、曲池，同時(shí)選取雙側(cè)腎俞穴之間，用多功能艾灸儀灸療，每日1次，每次15min，治療中間按上述穴位順序行針1次，采用平補(bǔ)平瀉法，共治療14天。

3 標(biāo)本采集

膝關(guān)節(jié)取材:大鼠稱質(zhì)量，用20%烏拉坦腹腔麻醉(4ml/kg)，仰位固定，沿左側(cè)后腿膝關(guān)節(jié)正中縱行切開皮膚，直至暴露出以膝關(guān)節(jié)為中心約3cm×3cm的區(qū)域，可見白色的髕韌帶，沿髕韌帶下方將其剪開，用止血鉗夾住髕韌帶斷端將髕骨向上掀起，再分別沿髕骨兩側(cè)向上分離至股骨，此時(shí)即打開了膝關(guān)節(jié)腔，可見由髕骨下極向下延續(xù)有一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織，用眼科剪緊貼關(guān)節(jié)面邊緣將滑膜完整剪下，用眼科直鑷夾起置10%的中性甲醛中固定。同法取右側(cè)滑膜。

4 觀察項(xiàng)目

4．1 多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分

全身病變按5級(jí)評(píng)分法［3］進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)未注射佐劑的其余3個(gè)肢體的病變程度累計(jì)積分，計(jì)算出AI。0分:無(wú)紅腫;1分:小趾關(guān)節(jié)紅腫;2分:趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹;3分:踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹;4分:包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。把3個(gè)關(guān)節(jié)的積分累計(jì)起來，即為每只大鼠的AI，總分為0～12分。

4．2 滑膜組織TNF－α、IL－10表達(dá)檢測(cè)(RT－PCR)

1)提取總RNA;2)RNA逆轉(zhuǎn)錄;3)DNA聚合酶鏈反應(yīng)(PCR);4)RT－PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)。

4．3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

5 結(jié)果

5．1 AA大鼠關(guān)節(jié)炎變化觀察

針灸可以改善AA大鼠多關(guān)節(jié)炎指數(shù)，而且調(diào)督通脈針灸法優(yōu)于普通針灸法(見表1)。

表1 各組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較(±s)

表1 各組大鼠多發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)變化比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，△P ＜0．05;與模型組比較，☆P ＜0．05，★P＜0．01;調(diào)督通脈針灸組與普通針灸組比較，※P＜0．05

組別 n 針灸前 針灸第7天 針灸第14天空白對(duì)照組(A)10 0±0 0±0 0±0模型組 10 9．5 ±1．581△ 8．2 ±1．751 6．4 ±1．163普通針灸組 10 9．3 ±1．494△ 6．7 ±1．059☆ 5．2 ±1．033☆調(diào)督通脈針灸組10 9．6 ±1．506△ 5．5 ±1．849★※ 4．2 ±1．023★※

5．2 滑膜組織mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

5．2．1 滑膜組織TNF－αmRNA表達(dá)變化

針灸能夠抑制AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜高表達(dá)的TNF－amRNA活性，而且調(diào)督通脈針灸法優(yōu)于普通針灸法(見表2)。

表2 大鼠滑膜TNF－amRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

表2 大鼠滑膜TNF－amRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，△P＜0.01;與模型組比較，☆P＜0.05，★P＜0.01;調(diào)督通脈針灸組與普通針灸組比較，※P＜0．05

組別n TNF－a空白對(duì)照組(A)10 0．134 2 ±0．005 2模型組(B) 10 0．741 8 ±0．010 1△普通針灸組(C) 10 0．475 3 ±0．006 5☆調(diào)督通脈針灸組(D) 10 0．243 6 ±0．037 6★※

5．2．2 滑膜組織IL－10mRNA表達(dá)變化

針灸能夠提高AA大鼠關(guān)節(jié)滑膜IL－10mRNA表達(dá)水平，而且調(diào)督通脈針灸法優(yōu)于普通針灸法(見表3)

表3 大鼠滑膜IL－10mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

表3 大鼠滑膜IL－10mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較(±s)

注:與空白對(duì)照組比較，△P＜0．01;與模型組比較，☆P ＜0．05，★P ＜0．01;調(diào)督通脈直灸組與普通針灸組比較，※P ＜0．05。

組別n IL－10空白對(duì)照組(A)10 0．5499 ±0．0157模型組(B) 10 0．1684 ±0．0354△普通針灸組(C) 10 0．3438 ±0．0185☆調(diào)督通脈針灸組(D) 10 0．5460 ±0．0162★※

6 討論

細(xì)胞因子是感染、炎癥和免疫性疾病的重要介質(zhì)。許多細(xì)胞因子已被公認(rèn)為是RA關(guān)節(jié)損傷和炎癥的重要介質(zhì)，這些細(xì)胞因子參與RA的整個(gè)病理過程。與RA相關(guān)的細(xì)胞因子有 TNF－a、IL－10、IL－1、IL－2等，這些細(xì)胞因子對(duì)滑膜細(xì)胞分化、增殖、和分泌有調(diào)節(jié)作用。在RA的發(fā)病中，對(duì)炎癥過程有抑制或促進(jìn)作用，其中與RA關(guān)系最為密切的細(xì)胞因子有TNF－a、IL－10 等［4－6］。在影響 RA 細(xì)胞因子的研究中，以腫瘤壞死因子倍受矚目。TNF－a在RA的發(fā)病機(jī)制中起到重要的作用。IL－10是近年來發(fā)現(xiàn)并克隆表達(dá)的一種細(xì)胞因子，具有很強(qiáng)免疫調(diào)控及免疫抑制作用，能抑制巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的抗原遞呈功能，從而抑制多種促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生［7］，在RA的發(fā)病中起著一定作用。IL－10能增加RA抗炎因子并減少RA致病性促炎因子。

有研究表明，針灸具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用［8］。本研究以調(diào)督通脈針灸法為研究方法，其是以貫通督脈之陽(yáng)氣，疏通四肢之經(jīng)脈為法則，達(dá)到調(diào)和陰陽(yáng)，平和氣血的目的。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，此法可降低滑膜組織TNF－a表達(dá)和增高IL－10的表達(dá)，通過調(diào)節(jié)上述細(xì)胞因子的表達(dá)，表現(xiàn)出雙向調(diào)節(jié)作用，使免疫功能的失衡得到了較好的調(diào)整。這可能是在分子水平針灸治療RA的機(jī)制之一。

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