張雨薇，馬麗娟，李秋元，趙春燕，孫世曉

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2．浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，浙江 杭州 310053;3．吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)部，吉林 長春 130021)

我國是心血管病高發(fā)地區(qū)，其中很多疾病發(fā)展到終極階段，會演變?yōu)楹蠊喈?dāng)危險的充血性心力衰竭。究其原因是由于心肌收縮力的嚴(yán)重下降，進(jìn)而射血能力減弱，最后會累及全身各大器官、系統(tǒng)，甚至衰竭。因此，迫切需要找到一些新的藥品，從增強收縮力的角度來治療該疾病。這種強心治療的方法在很多的國家都還在應(yīng)用，用來改善心功能，用后取得了一定的效果。

五加科藥用植物－龍芽楤木(Aralosides As)莖葉中存在的主要物質(zhì)是皂苷［1］。據(jù)報道，As對心血管系統(tǒng)產(chǎn)生了多方面的作用，其作用之一是正性肌力作用。這個結(jié)論來源于對很多實驗?zāi)Ｐ偷挠^察研究:如利用蛙離體肌肉標(biāo)本，貓、犬、大鼠的心臟模型，Langendorff技術(shù)灌流離體大鼠心臟模型，觀察其對收縮性的直接影響［2－5］，皆觀察到 As顯現(xiàn)出正性肌力作用，但是以往沒有實驗從心肌膜上鈉離子改變的角度探討其實現(xiàn)強心作用的機(jī)制。本研究旨從分子水平上對其作用機(jī)制作進(jìn)一步闡述，希望能為該藥開發(fā)為具有自主知識產(chǎn)權(quán)的藥物提供新的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 材料 AS(由吉林大學(xué)生理實驗室提供);DMEM(博大生物公司);胰蛋白酶(Sigma公司);新生胎中血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);其余試劑物為國產(chǎn)分析純。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)方法［6］

1．3 用膜片鉗記錄鈉離子流［7］

先將玻璃毛坯夾到預(yù)熱的微電極拉制器上，拉制成毛坯尖端內(nèi)徑1μm左右，再進(jìn)行拋光。在電極內(nèi)通過虹吸的原理用注射器充上電極液，如發(fā)尖端有氣泡存在，輕彈毛坯除去。另外還要盡量保持電極的潔凈，控制胞內(nèi)液的成分及pH值，是通過微電極的細(xì)胞內(nèi)透析實現(xiàn)的。在記錄電流以前，在浴液和電極液中預(yù)先加入了一些阻斷其他離子的阻斷劑，并且通過實驗證明河豚毒素可阻斷該電流。因此，確保記錄中得到的是純凈的Ina。

1．4 實驗分組 以隨機(jī)選取生長狀態(tài)良好、中等大小的心室肌細(xì)胞為研究對象，分對照組、As不同劑量組，在浴液中分別加入 As1μg/ml，10μg/ml，100μg/ml后，觀察給藥前后INa幅值變化。

1．5 數(shù)據(jù)分析處理

實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用t檢驗分析實驗數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度的As對INa的影響 見表1，圖1。

實驗結(jié)果顯示，As中、高組明顯升高鈉電流幅值，組間有明顯的差異。

A鈉電流對照曲線B、C、D分別為不同As劑量組(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)作用后曲線。

2．2 未加藥組和加As組對心肌細(xì)胞INa的電流－電壓曲線影響

記錄Ina時的儀器參數(shù):如保持電位、去極化電位、波寬等［8］，當(dāng)細(xì)胞和電極達(dá)到良好封接后，在不同激活電壓下開始記錄電流。記錄到INa幅值作出電流－電壓曲線(圖2)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，As除可使電流幅值增高，其他參數(shù)沒變化。

表1 正常對照組和不同濃度的AS對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞Na+通道的影響(n=10,±s)

表1 正常對照組和不同濃度的AS對培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞Na+通道的影響(n=10,±s)

注:與對照組相比較，＊＊P ＜0．01

分組 激活電壓(mV)電流幅值(nA)電壓峰值(mV)反轉(zhuǎn)電壓(mV)未處理組 －55to60 －4．070±1．278 －40 0 1 －55to60 －4．250±1．530 －40 0 10 －55to60 －5．239±1．757＊＊ －40 0 100 －55to60 －5．720±1．689＊＊ －40 0

圖1 不同濃度的As對Ina幅值的影響

圖2 As低、中、高劑量對心肌細(xì)胞INa的電流－電壓曲線影響

3 討論

很多文獻(xiàn)［2－5］顯示，As在不同的動物模型都顯現(xiàn)出強心的效應(yīng)。但是，在培養(yǎng)心肌細(xì)胞液中加入As，從離子通道水平上進(jìn)行研究其強心作用，并未見報道。所以，在實驗中以膜片鉗技術(shù)作為研究手段，直接有效的觀察了As對膜鈉通道電流產(chǎn)生的影響，探討其正性肌力作用的可能機(jī)制。

鈣離子對心肌生物電的形成至關(guān)重要，其一可參與心室肌細(xì)胞動作電位的形成，在平臺期內(nèi)流，進(jìn)而發(fā)揮觸發(fā)興奮－收縮耦聯(lián)的作用。心肌的收縮過程是通過興奮收縮－耦聯(lián)過程引起，帶動肌絲滑行實現(xiàn)的。因此，胞漿中Ca2+濃度的高低對心肌的收縮和舒張起著關(guān)鍵性的作用，Chu等也觀察到鈣離子的濃度在觸發(fā)心肌收過程中起關(guān)鍵作用［9］。胞漿中鈣濃度增加的途徑可以是外鈣內(nèi)流產(chǎn)生的，也可以是細(xì)胞內(nèi)肌質(zhì)網(wǎng)釋放的，還可能是通過膜上的鈉鈣交換體進(jìn)入的［10］。

本實驗觀察了不同濃度As對鈉電流影響，在實驗中盡量避免和減少Run－down［11］，記錄結(jié)果均取自封接穩(wěn)定后5min的結(jié)果。結(jié)果中、高濃度的As劑量依賴性的對鈉通道電流產(chǎn)生明顯作用，其可使鈉電流幅值增大。所以，As具有正性肌力作用機(jī)制之一是可能由于藥物作用于細(xì)胞膜，使得膜對鈉離子的通透性增加，順濃度差鈉離子內(nèi)流，增加了胞漿中鈉離子，激活了反向的鈉－鈣交換機(jī)制，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)鈣會增加，影響興奮－收縮藕聯(lián)過程，進(jìn)而實現(xiàn)其強心作用。關(guān)于As升高心肌細(xì)胞內(nèi)鈣的其他分子機(jī)制，尚待進(jìn)一步研究。

充血性心力衰竭發(fā)生后，機(jī)體的血流動力學(xué)發(fā)生明顯紊亂，心肌既表現(xiàn)出負(fù)性肌力作用，也存在明顯的舒張障礙。所以，當(dāng)充血性心力衰竭發(fā)展到嚴(yán)重階段，強心治療來改善整個的心功能意義重大。這種方法在很多國家仍在應(yīng)用，存在明顯優(yōu)勢，但以往很多的強心藥如洋地黃、磷酸二酯酶抑制劑、鈣增敏劑等通過不同的機(jī)制實現(xiàn)強心［12］。但是，有的副作用大，有的僅能增強收縮力，卻無法改善舒張功能，限制了它們的應(yīng)用。因此，迫切需要尋找出更多更好的其他類型的藥物，治療慢性心力衰竭。以往的實驗結(jié)果顯示［7］，As對心肌既有正性肌力作用，還有其他的優(yōu)勢。因此，此實驗為其作為新一代強心藥應(yīng)用提供了一些線索和實驗室依據(jù)。

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