東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所 許文杉 馮興軍

抗菌肽因具有分子量小、熱穩(wěn)定性高、殺菌范圍廣、作用機制獨特等特點，成為抗生素替代品的重要候選物，但其制備一直是研究與應(yīng)用的瓶頸?；蚬こ谭椒ㄊ墙鉀Q抗菌肽制備難題的有效途徑。巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)（Pichia pastoris）是目前抗菌肽基因和生物工程中重要的、應(yīng)用最為廣泛的表達系統(tǒng)之一，該系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代初興起的一種新型真核表達系統(tǒng)，具有基因重組操作相對簡單、能正確加工與修飾外源蛋白、表達量高、易純化且易大量發(fā)酵培養(yǎng)等優(yōu)點。迄今為止，已有400多種蛋白在該表達系統(tǒng)中成功高效表達（Cereghino和Cregg，2000）。運用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達Fowlicidins抗菌肽具有一定的現(xiàn)實意義。Fowlicidins是雞體內(nèi)的一類新型的Cathelicidin抗菌肽，其前體分子的氨基端含有一個高度保守的cathelin前片段，而羧基端的氨基酸序列具有特異性，具有廣譜的抗菌活性和避免抗菌劑耐藥性的潛能，是理想的候選抗菌藥物。

1 Fowlicidins的基本簡介

1.1 Fowlicidins的基因結(jié)構(gòu)和組織分布 迄今為止，已在雞基因庫中搜索到13種雞β-防御素，4種cathelicidins和1種新的肝臟表達的抗微生物肽（LEAP-2），其中cathelicidins的研究主要集中于哺乳動物有關(guān)于雞的研究報道較少（Ramanathan 等，2002）。 雞 cathelicidins包括 Fowlicidin-1 （cathelicidin-1，chCATH-1）、Fowlicidin-2（cathelicidin-2，chCATH-2）、Fowlicidin-3（cathelicidin-3，chCATH-3） 等 （Goitsuka 等 ，2007）。Fowlicidin在N端有一個高度保守的cathelin前序列，屬于cathelicidin家族。編碼Fowlicidins的3個基因都具有相似的結(jié)構(gòu)，即4個外顯子被3個內(nèi)含子間隔開來，起始的3個外顯子編碼信號肽和cathelin前片段，而最后的一個外顯子主要編碼成熟片段。這種基因結(jié)構(gòu)類型與哺乳動物Cathelicidins基因結(jié)構(gòu)類型是完全一致的，明確地指示出Cathelicidins基因在生物進化過程中有重要的保守性（Herr等，2007；Mookherjee 等，2007）。從Fowlicidins的起源來看，F(xiàn)owlicidin-1和Fowlicidin-3的產(chǎn)生很可能是基因復(fù)制的結(jié)果，因為其整個可讀框有著明顯的相似性，并且其基因的內(nèi)含子片段也有很高的相似性。Fowlicidin-2與Fowlicidin-1和Fowlicidin-3相比，在前三個外顯子編碼的肽片段上同樣有著明顯的同源性，但是在最后一個外顯子編碼的肽片段上卻有著很大的不同，或許Fowlicidin-2基因是直接從Fowlidicin-1或Fowlicidin-3復(fù)制而來的，但不是經(jīng)過外顯子改組而得來的，因而，家禽（雞）可能借此方式產(chǎn)生了在最后一個外顯子上有明顯序列趨異的多種Cathelicidins（史春林，2008）。

成熟的雞Fowlicidins是富含精氨酸的單鏈分子，氨基酸數(shù)量為26～32，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、產(chǎn)單孢李氏菌等細菌對其高度敏感。Albert等（2005）從雞骨髓細胞中克隆出一種新奇的雞cathelicidin——雞骨髓抗菌肽，命名為 CMAP27。 隨后，Xiao 和 Yi（2006）從雞肝臟中克隆出3種雞Cathelicidins，即Fowlicidin-1，F(xiàn)owlicidin-2和Fowlicidin-3，其中Fowlicidin-3與CMAP27通過序列比對有100%同源性，應(yīng)該視為同一抗菌肽。Fowlicidins在盲腸扁桃腺、法氏囊和骨髓中的表達量很高，在皮膚組織有表達量較低，但是在尾脂腺中卻有極高的表達量。以上此類分泌型的腺油脂含有抗菌特性的烷基代石蠟酸和乙醇，可以為禽類抗感染提供保護作用。鑒于Cathelicidin類抗菌肽在與哺乳動物皮膚相關(guān)的先天免疫中發(fā)揮重要的效應(yīng)作用，或許Fowlicidins對宿主也有同樣的作用 （Zanetti等，2002；Cole等，2001）。因此，F(xiàn)owlicidins短肽與腺油脂一同分泌，遍布全身羽毛和皮膚，其可能對抗皮膚病原菌的先天免疫有重要作用。

1.2 Fowlicidins的抗菌特性和抗菌機制 Fowlicidin-3在畢赤酵母中的表達產(chǎn)物對大腸桿菌K88和金黃色葡萄球菌均有一定抑菌活性，目的蛋白分子質(zhì)量約3.1 kDa，所表達的抗菌肽Fowlicidin-3有作為抑菌藥物的潛力 （陳軼群等，2009）。雞源Fowlicidin-3抗菌肽具有較強的熱、酸穩(wěn)定性，對致病性大腸桿菌K99、雞白痢沙門氏菌和金黃色葡萄球菌CowanⅠ的最小抑菌濃度分別為 3.12、1.56μg/mL 和 1.56μg/mL。 在對大腸桿菌O1感染雛雞的體內(nèi)療效試驗中，雞源Fowlicidin-3顯示出了較好的預(yù)防和治療效果（李榮榮等，2011）。相對而言，重組抗菌肽Fowlicidin-1的抑菌作用更為廣泛，對大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)單孢李氏菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用（史春林，2008）。還有試驗數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)owlicidins對細菌的最小抑菌濃度在0.4～2.0μg/mL，并有較強的結(jié)合內(nèi)毒素能力，而且還具有強有力的、不依賴鹽離子的、廣譜的抗菌活性，是目前已知的活性最強的抗菌肽之一 （Xiao和Yi，2006）。Fowlicidins抑制大腸桿菌所需的最小藥物濃度（MIC）為1.59～2.66μg/mL。SMAP-29是目前所報道的最有效的Cathelicidin抗菌肽，與其相比，F(xiàn)owlicidins表現(xiàn)出很強的抗菌特性 （Zanetti等，2002；Shin等，2001）。但是，與多數(shù)抗菌肽不同的是Fowlicidins抗菌活性不受生理鹽濃度的影響，甚至在NaCl濃度為150 mmol/L時，仍然保持著抗菌活性，并且對抗性菌株有很強的抑制作用，這意味著Fowlicidins在抗感染治療應(yīng)用上有著很大的潛力。

到目前為止，F(xiàn)owlicidins的確切抗菌機制還沒有被確定。普遍認(rèn)為Fowlicidins是通過在微生物壁膜上形成多聚體孔道而裂解細胞的。Bommineni等（2007）研究表明，F(xiàn)owlicidins是以多聚體的形式作用于微生物膜壁上，并在其上形成膜孔；Fowlicidins首先以單體或多聚體的形式通過靜電作用結(jié)合在膜上，然后互相識別形成多聚體并插入到膜的疏水核中，并與膜的脂層相互作用形成通道；同時其他單體或小的多聚體繼續(xù)結(jié)合上來使通道的孔徑擴大，細菌因而失去膜勢，不能保持正常滲透壓而死亡。顯然，不同的抗菌肽采用不同的抗菌機制，并且對于一個給定的抗菌肽其作用模式同樣因作用菌種的不同而有所不同（Ramanathan等，2002）。 因此，進一步探究 Fowlicidins的疏水性、凈帶正電荷量、構(gòu)象的柔韌度以及二級結(jié)構(gòu)與其抗菌作用之間的相互關(guān)系，對揭開Cathelicidins類抗菌肽的作用機制及其在抗感染應(yīng)用方面都有積極意義。

2 Fowlicidins在畢赤酵母中的表達

2.1 畢赤酵母表達系統(tǒng) 巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)具有繼代穩(wěn)定，可以高密度發(fā)酵，在發(fā)酵過程中自身分泌的蛋白少，外源蛋白表達量高等優(yōu)點，而且在其分泌表達抗菌肽時，自身不受其殺菌活性的影響，還能保證抗菌肽分子的正確結(jié)構(gòu)和適度的糖基化，從而保證其天然活性，是一種高效蛋白表達體系（唐元家和余柏松，2002）。

2.2 影響Fowlicidins表達的因素 在畢赤酵母表達系統(tǒng)中，影響Fowlicidins外源性基因表達因素有目的基因的拷貝數(shù)、目的基因的特性、甲醇利用表型、產(chǎn)物穩(wěn)定性和培養(yǎng)條件等。

2.2.1 目的基因的拷貝數(shù) 由于基因的劑量效益，隨著克隆中拷貝數(shù)的增加，蛋白質(zhì)的表達可能會增加。多拷貝整合有利于充分發(fā)揮畢赤酵母的表達潛能。Vacca等（2000）的研究結(jié)果顯示，在1～8整合拷貝數(shù)范圍內(nèi)，HBsAg表達量隨基因劑量的增加而成比例升高。也有極少研究表明，增加拷貝數(shù)反而降低了表達水平（Karine和Dev，2010）。由此可見，基因整合拷貝數(shù)與表達水平間并不是簡單的正比關(guān)系，有時拷貝數(shù)增加反而會對表達產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)，高拷貝低表達的原因可能在于mRNA翻譯、蛋白質(zhì)折疊效率的限制，這和目的蛋白的大小、結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系?；蚩截悢?shù)對表達量的影響很難預(yù)測，所以在獲得多拷貝重組子的基礎(chǔ)上，要進一步篩選確定因具有合適拷貝數(shù)而顯示最佳表達水平的菌株，也就是高表達菌株的篩選應(yīng)以表達的蛋白量為最終標(biāo)準(zhǔn)。可利用SDS-PAGE、菌落免疫印跡和活性分析等方法檢測目的蛋白質(zhì)的表達水平。

2.2.2 目的基因的特性 由于特定的A+T富含區(qū)可作為多腺苷酸或轉(zhuǎn)錄終止信號，因此高A+T含量的外源基因在此系統(tǒng)中不能有效的轉(zhuǎn)錄 （李琦等，2005）。外源基因序列中的mRNA 5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）的核苷酸序列和長度是影響外源基因能否高效表達的又一重要因素。此外，在設(shè)計基因時選用畢赤酵母偏好密碼子可提高轉(zhuǎn)錄的成功率。

2.2.3 甲醇利用表型 使用不同的宿主菌或線性化酶切位點，可產(chǎn)生不同的甲醇利用表型。然而很難將轉(zhuǎn)化子表型與表達量之間建立明確和必然的關(guān)系，應(yīng)根據(jù)試驗情況，考察自身基因在各表型各菌株中的表達情況，最終選擇特定的株型（Dai等，2000）。

2.2.4 產(chǎn)物穩(wěn)定性 外源蛋白對蛋白酶的敏感與否也影響蛋白的產(chǎn)量。通常采用調(diào)整pH改變酶活性；培養(yǎng)基中添加1%酪氨酸蛋白水解物；或使用蛋白酶缺陷受體菌SMD1168來減少蛋白酶對外源基因表達的影響（Sreekrishna等，1997）。

2.2.5 培養(yǎng)條件 外源基因的表達水平受培養(yǎng)基組成、緩沖液pH、甲醇濃度、培養(yǎng)溫度、通氣狀況、誘導(dǎo)物濃度及時間等因素的影響。

3 展望

隨著對Fowlicidins等相關(guān)抗菌肽研究的不斷深入，必將開創(chuàng)治療微生物感染類疾病的新紀(jì)元?？紤]到Fowlicidins有著強有力的、不依賴鹽離子的、廣譜的抗菌活性，在機體免疫中有一定調(diào)節(jié)作用；而且其抗菌機制完全不同于傳統(tǒng)抗生素，因此通過基因工程方法，利用細胞依賴或無細胞型蛋白表達系統(tǒng)生產(chǎn)重組Fowlicidins抗菌肽將會有重大意義（Ingham和Moore，2007）。目前研究的重點是如何實現(xiàn)抗菌肽產(chǎn)量的突破，以滿足試驗研究及臨床應(yīng)用的需求。隨著Fowlicidins表達量的不斷提高，對其抗菌機制的深入研究、臨床抗微生物活性鑒定及在其他藥學(xué)應(yīng)用上的評定有很大推進作用。

[1]陳軼群，李志民，曹云鶴.抗菌肽Fowlicidin-3在畢赤酵母中得表達及產(chǎn)物活性[A].中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會2009學(xué)術(shù)年會論文集[C].2009.463～465.

[2]李琦，秦詠，張寧.應(yīng)用巴氏畢赤酵母表達基因工程藥物的影響因素[J].藥品評價，2005，2（3）：172 ～ 175.

[3]李榮榮，和禎泉，呂英軍.雞源抗菌肽Fowlicidin-3表達條件的優(yōu)化及生物學(xué)特性和體內(nèi)療效研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34（2）：113～118.

[4]史春林.重組抗菌肽Fowlicidin-1的制備及其抑菌活性檢測：[碩士學(xué)位論文][D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.11.

[5]唐元家，余柏松.巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)[J].國外醫(yī)藥（抗生素分冊），2002，23（6）：246 ～ 271.

[6]Albert V D，Edwin J A，Veldhuizen.CMAP27，a novel chichen cathelicidin-like antimicrobial pritein[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2005，106（1）：321 ～ 327.

[7]Bommineni Y R，Dai H，Gong Y X.Fowlicidin-3 is an α-helical cationic host defense peptide with potent antibacterial and lipopolysaccharide-neutralizing activities[J].FEBS.2007，274（2）：418 ～ 428.

[8]Cereghino J L，Cregg L M.Heterologous Protein Expression in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris[J].FEMS Microbiol Rev，2000，24（1）：45～66.

[9]Cole A M，Shi J，Ceccarelli A.Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds Blood[J].Microbial Cell Factories，2001，97（1）：297 ～ 304.

[10]Dai X Y，WangY X，Zhou J，et al.Isolation and Charaeterization of PAOX2 Mutant in Pichia pastoris[J].Yi Chuan Xue Bao，2000，27（7）：641 ～646.

[11]Goitsuka R，Chen C L，Benyon L，et al.Chickencathelicidin-B1，an antimicrobial guardian at themucosal M cell gateway[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（38）：15063 ～ 15068.

[12]Herr C，Shaykhiev R，Bals R.The role of cathelicidin and defensins in pulmonary inflammatory diseases[J].Expert Opin Biol Ther，2007，7（9）：1449～1461.

[13]Ingham A B，Moore R J.Recombinant production of antimicrobial peptides in heterologous microbial systems[J].Biotechnol Appl Biochem，2007，47（1）：1 ～ 9.

[14]Karine S，Dev S.Secretion of an Endogenous Subitilish by Pichia pastoris Strains GS115 and KM71 [J].Applied and Environmental Microbiology，2010，76（13）：477 ～ 490.

[15]Mookherjee N，Rehaume L M，Hancock R E.Cathelicidins and functional analogues as antisepsis molecules[J].Expert Opin Ther Targets，2007，11（8）：993～1004.

[16]Ramanathan B，Davis E G，Ross C R.Cathelicidins：microbicidal activity，mechanismsof action，and roles in innate immunity[J].Microbes Infection，2002，4（3）：361 ～ 372.

[17]Shin S Y，Park E J，Yang S T，et al.Structure-activity analysis of SMAP-29，a sheepleukocytes-derived antimicrobial peptide[J].Biochem Biophys Res Commun，2001，285（4）：1046 ～ 1051.

[18]Sreekrishna K，Brankamp R G，Kropp K E，et al.1997.Strategies for Optimal Synthesis and Secretion of Heterologous Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris[J].Gene，1997，190（1）：55 ～ 62.

[19]Vacca F，Bagnato A，Catt K J.Transactivation of the epidermal growth factor receptor in endothelin-1-induced mitogenic signaling in human ovarian carcinoma cells[J].Cancer Res，2000，60（18）：5310 ～ 5317.

[20]Xiao Y，Yi B C.Identifiation and Functional Characterization of Three Chicken Cathelicidins with Potent Antimicrobial Activity[J].Biololgical chemistry，2006，28（1）：2858 ～ 2867.

[21]Zanetti M，Gennaro R，Skerlavaj B，et al.Cathelicidin peptides as candidates for a novel class of antimicrobials[J].Curr Pharm Des，2002，8（9）：779 ～ 793.