張 涵，吳 昭，黃 華，孫曉丹，安沂華

（1.首都醫(yī)科大學(xué)北京市神經(jīng)外科研究所，北京 100050；2.清華大學(xué)材料科學(xué)與工程系，北京 100086）

神經(jīng)系統(tǒng)作為生物體內(nèi)電活動最為活躍的部分之一，電磁場作用對其有著特別重要的意義（1），成為神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的研究熱點之一。聚吡咯（PPy）是近年來新興的具有較好組織相容性的導(dǎo)電材料。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hUC-MSC）是近年來間充質(zhì)干細(xì)胞研究中的熱點，是未來干細(xì)胞應(yīng)用中的重要成員。然而，將hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)，對不同條件的電刺激對細(xì)胞形態(tài)和貼附的影響的研究還十分少見。本實驗將hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)，對細(xì)胞在不同通電情況下的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行研究，對闡明由PPy介導(dǎo)的直接電刺激對hUC-MSC的影響提供初步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

PPy由清華大學(xué)材料系提供

試劑：αMEM（Hyclon公司），胎牛血清（Hyclon公司），無色低糖DMEM（Gibco公司），4％多聚甲醛（Sigma公司），0.25％胰酶（含0.02％EDTA） （Sigma公司）；細(xì)胞流式檢測抗體（均為小鼠IgGl抗體）：PE-CD29單克隆抗體，F(xiàn)ITC-CD44單克隆抗體，PE-CD54單克隆抗體，PE-CD 45單克隆抗體，F(xiàn)ITC-CD 106單克隆抗體，F(xiàn)ITC-CD14單克隆抗體，PE-CD34單克隆抗體，F(xiàn)ITC-HLA-DR單克隆抗體（美國BD BDIS公司）；

主要儀器：電極：銅鍍鋅電極；掃描電鏡（HITACHI TM-1000）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀及CellQuest軟件（Becton Dickinson）

1.2 hUC-MSC分離培養(yǎng)與鑒定

選擇健康的正常孕周的剖腹產(chǎn)產(chǎn)婦，經(jīng)其同意后，于手術(shù)后取臍帶約5～10 cm，無菌條件下去除其表面羊膜及臍帶內(nèi)血管，取Wharton’s Jelly，于生理鹽水中清洗3次后，剪成體積約1 cm3的小塊，置于含10％胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中采用貼壁法進(jìn)行培養(yǎng)，每5～7 d進(jìn)行傳代。收集第3～6代的細(xì)胞，利用倒置相差顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。

1.3 PPy制備

選用對甲基苯磺酸鈉（TsONa）為支持電解質(zhì)，加入對甲基苯磺酸（TsOH）為添加劑，采用三電極電化學(xué)體系制備PPy薄膜。

1.4 hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)及通電刺激

選擇第 3～6代的hUC-MSC，制備成濃度為0.25×106/m L的細(xì)胞懸液，接種于面積為4 cm2的PPy表面，加入培養(yǎng)基5 m L，置于5％CO2、37℃環(huán)境內(nèi)共培養(yǎng)24 h，換入無血清無色低糖DMEM作為通電時的培養(yǎng)基后進(jìn)行通電刺激，通電后換回原含血清αMEM培養(yǎng)基。

1.5 實驗分組

（1）對照組：將hUC-MSC置于蓋玻片上，在含有10％胎牛血清的αMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d

（2）不加電組：將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)3 d

（3）控制電壓組：將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)24 h后，施加電刺激，將場強(qiáng)控制為100 mV/mm，由于PPy上兩電極間距離為3.5 cm，因此控制電壓V= 3.5V，通電時間t=1 h/d，連續(xù)通電3 d。

（4）控制電流組：將hUC-MSC于PPy共培養(yǎng)24 h后，施加電刺激，將電流控制為I=10mA，通電時間t=1 h/d，連續(xù)通電3 d。

1.6 hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)后SEM檢測

hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)并通電3 d后，室溫下置于4％多聚甲醛中固定4 h，生理鹽水沖洗，掃描電鏡觀察細(xì)胞在PPy表面貼附情況及細(xì)胞形態(tài)變化。

1.7 hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)4d后，收集其培養(yǎng)基，光鏡下觀察是否仍有細(xì)胞懸浮。

2 結(jié)果

2.1 hUC-MSC鑒定

光鏡下顯示第3～6代時，單個細(xì)胞多呈梭形類似于成纖維細(xì)胞形態(tài)，折光性良好，細(xì)胞生長密度增加趨于融合時，呈現(xiàn)平行排列或典型魚群樣生長，均一性良好。采用流式細(xì)胞儀對第3～6代細(xì)胞進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)其不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34、CD45、CD14、CD106和HLA-DR，而MSCs黏附分子和基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記CD44、CD29、CD54均呈高表達(dá)（數(shù)據(jù)未顯示）。

2.2 hUC-MSC單獨或與PPy共培養(yǎng)后SEM觀察

2.2.1 對照組

hUC-MSC單獨培養(yǎng)，電鏡下可見hUC-MSC在蓋玻片上貼附，細(xì)胞呈魚群樣或平行樣排列，絕大部分呈梭形，形態(tài)飽滿，邊緣清晰，部分細(xì)胞伸出細(xì)長偽足。（彩插2圖1）

2.2.1 不加電組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，主要聚集貼附于局部地區(qū)，其他地區(qū)基本未見有細(xì)胞分布。細(xì)胞基本呈長梭形，形態(tài)飽滿，邊緣較為清晰，可見細(xì)胞伸出細(xì)長偽足，細(xì)胞在密度較大的區(qū)域呈現(xiàn)平行排列生長。（彩插2圖2）

2.2.2 控制電壓組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，主要聚集貼附于局部地區(qū)，其他地區(qū)也有分布。細(xì)胞基本呈扁平狀，細(xì)胞間的分界不清，常匯合成片，在PPy表面突起較為明顯時，細(xì)胞可伸展為扁平薄片狀，部分細(xì)胞表面出現(xiàn)破損（彩插2圖3）。

2.2.3 控制電流組

電鏡下可見hUC-MSC在PPy表面貼附，總體較為均勻，在部分地區(qū)更為密集，其他地區(qū)稍少。細(xì)胞基本呈扁平狀，細(xì)胞間常匯合成片、分界不清。在細(xì)胞密度較大時局部有重疊增厚現(xiàn)象（彩插2圖4）。

2.3 光鏡下觀察hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)4d后培養(yǎng)基

光鏡下可見3個實驗組培養(yǎng)基中均有較多量細(xì)胞懸浮。將懸浮細(xì)胞離心后重新接種于培養(yǎng)瓶中，3～5 d后仍可出現(xiàn)典型梭形細(xì)胞呈魚群樣生長。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)的電活動活躍，電刺激對其損傷修復(fù)具有明顯的影響。如何利用這個特性對神經(jīng)損傷進(jìn)行修復(fù)是近年來相關(guān)研究的方向之一。

hUC-MSC是近年來干細(xì)胞研究中的熱點，具有干細(xì)胞的基本特性即自我更新能力及多向分化潛能，目前認(rèn)為，hUC-MSC可能通過“替代作用”和/或“營養(yǎng)作用”促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)，雖然其修復(fù)機(jī)制尚未明確，但已有多項研究證明這種修復(fù)作用是十分顯著的［2-4］。而且其分離提取不對產(chǎn)婦和新生兒造成額外損傷，并規(guī)避了有關(guān)的醫(yī)學(xué)倫理問題，體外培養(yǎng)方法較為簡便，因此成為未來干細(xì)胞臨床應(yīng)用的重點研究對象之一。聚吡咯本身即具有導(dǎo)電性能，容易制備，表面特性易于改變，且具有良好的組織相容性［5-7］，可顯著降低星形膠質(zhì)細(xì)胞的黏附、聚集，減少膠質(zhì)瘢痕的形成［8］，并可在外源性電場影響下促進(jìn)粘附其上的神經(jīng)細(xì)胞的軸突有方向性地延伸［9］。本研究針對神經(jīng)組織的特點，采用聚吡咯作為支架，與hUC-MSC共培養(yǎng)，對體外條件下不同通電情況對細(xì)胞的影響進(jìn)行初步研究，可為將來將兩者結(jié)合修復(fù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供初步依據(jù)。

研究結(jié)果顯示，電刺激對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響主要體現(xiàn)在以下幾個方面：

（1）PPy表面細(xì)胞分布

hUC-MSC可在通電和不通電的情況下貼附于PPy表面，但貼附情況不盡相同。從對照組結(jié)果可見，普通培養(yǎng)條件下，在貼附條件適合的情況下，大部分細(xì)胞可均勻貼附于介質(zhì)表面。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)于PPy表面且不通電時，大部分細(xì)胞集中于部分地區(qū)，其他地方細(xì)胞較少。相比之下，通電時貼附分布地相對均勻，控制電流時此種現(xiàn)象更為明顯，提示電刺激可能促進(jìn)細(xì)胞在局部遷移，但這改變很有限。同時，在兩種不同方式的通電實驗組中，均未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在PPy支架的正負(fù)極的分布有明顯區(qū)別。

（2）細(xì)胞形態(tài)

實驗結(jié)果顯示，電刺激對貼附于PPy上的hUCMSC形態(tài)影響顯著。對照組中，細(xì)胞保持梭形，形態(tài)飽滿，分界清晰，細(xì)胞匯合少見。培養(yǎng)于PPy表面無電刺激時，hUC-MSC基本保持梭形，細(xì)胞間分界清楚，呈平行排列或典型魚群樣生長；施加電刺激后，細(xì)胞主要呈扁平薄皮狀，細(xì)胞間常匯合成片、分界不清。不同形式的電刺激對細(xì)胞形態(tài)影響的比較類似。

產(chǎn)生上述現(xiàn)象的原因可能包括：

（1）細(xì)胞形態(tài)改變的主要是由于細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞膜-骨架聯(lián)系的解體。據(jù)報道，外加電刺激可以引起細(xì)胞骨架重排［10］，對細(xì)胞形狀及變形產(chǎn)生重要影響，從而可能使細(xì)胞的外觀產(chǎn)生顯著變化，也對細(xì)胞的遷移產(chǎn)生了一定的促進(jìn)。

（2）外加電刺激可能導(dǎo)致細(xì)胞膜彈性有一定程度的增加，因而進(jìn)一步影響了細(xì)胞的運(yùn)動以及細(xì)胞—細(xì)胞間作用［11］。

（3）對hUC-MSC來說，細(xì)胞膜與細(xì)胞骨架之間的聯(lián)系相對分化成熟細(xì)胞較為松弛［12］，從而導(dǎo)致其對外界刺激更加敏感，對外界的反應(yīng)也更加顯著。

（4）hUC-MSC與PPy共培養(yǎng)數(shù)天后仍有較多細(xì)胞未貼附，說明PPy雖然具有較好的組織相容性，但其表面性質(zhì)仍然較不適宜hUC-MSC，故這也是今后的工作中需要進(jìn)一步改進(jìn)的。同時也不排除因為外加電刺激對細(xì)胞產(chǎn)生影響，減低了hUC-MSC的貼附性。

此外，處于電場中和直接與導(dǎo)電材料接觸對細(xì)胞的影響有著顯著的不同。實驗中所選擇的外加電刺激強(qiáng)度主要依據(jù)以往文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)。其中場強(qiáng)100mV/mm及以上在研究電場對細(xì)胞作用時較為常用［13-14］；電流I=10mA及以上在研究導(dǎo)電流對細(xì)胞作用時較為常用［15］。通過實驗結(jié)果可以看出，將適用于電場的數(shù)據(jù)直接套用于導(dǎo)電材料實驗，對于細(xì)胞的破壞性可能更大。

綜上所述，利用生理性電磁場或者外加電磁場對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)是未來研究方向之一，聚吡咯與hUC-MSC相結(jié)合在這個方面具有很強(qiáng)的可操作性，但是現(xiàn)階段仍然面臨很多問題，需要進(jìn)一步的實驗研究加以解決。

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