翁謝川，樊 星，王青秀，施 暢，李磊寧，歐陽(yáng)兆和，孔 琦，王全軍，關(guān)勇彪，丁日高

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所神經(jīng)生物學(xué)研究室，北京 100850；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，國(guó)家北京藥物安全評(píng)價(jià)中心，北京 100850）

藥物可能作為過(guò)敏原引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)。藥源性過(guò)敏反應(yīng)對(duì)人體危害性大，且發(fā)病率高。常見(jiàn)的過(guò)敏癥狀包括皮疹、惡心、嘔吐、支氣管哮喘、變應(yīng)性鼻炎，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)生過(guò)敏性休克、心功能衰竭等，危及生命［1］。因此，評(píng)價(jià)藥物可能引起的過(guò)敏反應(yīng)成為新藥臨床前安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要內(nèi)容。根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局（State Food and Drug Administration，SFDA）于2005年頒發(fā)的《化學(xué)藥物刺激性、過(guò)敏性和溶血性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》以及《中藥、天然藥物免疫毒性（過(guò)敏性、光過(guò)敏反應(yīng)）研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》相關(guān)規(guī)定，局部給藥發(fā)揮全身作用的藥物（如注射劑和透皮吸收劑等）都需考察Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)［2，3］。

在SFDA頒布的指導(dǎo)原則中考察Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)最常見(jiàn)的方法為豚鼠（Guinea pig）全身主動(dòng)過(guò)敏試驗(yàn)（active systemic anaphylaxis，ASA）［2，3］。目前普遍認(rèn)為，該方法具有操作相對(duì)簡(jiǎn)單、敏感性好、結(jié)果穩(wěn)定和可重復(fù)性高等特點(diǎn)［4-7］。但是，在藥物臨床前安全性評(píng)價(jià)工作中，特別是在操作和制定該過(guò)敏試驗(yàn)具體方案時(shí)，一些可變的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素，如不同的致敏劑量、激發(fā)劑量、激發(fā)時(shí)間、激發(fā)途徑和激發(fā)次數(shù)等，明顯影響著豚鼠全身過(guò)敏的發(fā)生，從而影響到臨床前藥物過(guò)敏性的評(píng)價(jià)結(jié)果。因此，為了解決這些重要的可變性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素對(duì)研究結(jié)果存在的影響，我們對(duì)其進(jìn)行了研究。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)豚鼠，Dunkin Hartley品系，體重為300～400 g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2006-0009；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（軍）2007-0008。飼養(yǎng)于國(guó)家北京藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障設(shè)施內(nèi)。對(duì)飼養(yǎng)的環(huán)境溫度、濕度和噪音進(jìn)行嚴(yán)格控制，溫度控制在20℃±2℃，相對(duì)濕度（60±10）%左右，光照周期12 h∶12 h，光照時(shí)間為8∶00 AM～8∶00 PM，噪音在60 dB以下。另外，保持飼養(yǎng)環(huán)境中空氣流通，換氣次數(shù)達(dá)到（10～15）次/h。

1.2 試劑

氯化鈉注射液，石家莊四藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：100705118；牛血清白蛋白，Roche公司，生產(chǎn)批號(hào)：738328。

1.3 方法

每組12只，雌雄各半。在實(shí)驗(yàn)的第1、10和19天測(cè)量豚鼠體重，并對(duì)豚鼠的脫毛狀況進(jìn)行觀察記錄。動(dòng)物體重的測(cè)定時(shí)間在上午8∶00～9∶00期間進(jìn)行，體重測(cè)量結(jié)束后再飼以食料。

實(shí)驗(yàn)按照SFDA推薦的全身過(guò)敏實(shí)驗(yàn)的程序和模式進(jìn)行，分為3個(gè)階段（檢疫期、致敏期、激發(fā)期），即購(gòu)進(jìn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱完體重后，進(jìn)行10 d的檢疫期。檢疫期后，挑選生理狀況合格的動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分組。分別在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的第1天（一次致敏組），第1、3、5天（3次致敏組）或者1、3、5、7、9天（5次致敏組）進(jìn)行腹腔注射致敏；分別在實(shí)驗(yàn)的第12、19、26天根據(jù)組別進(jìn)行腹腔或者腿靜脈注射激發(fā)，激發(fā)劑量為致敏劑量2倍。實(shí)驗(yàn)共分9組，第一組：生理鹽水對(duì)照組；第二組：10 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發(fā)）；第三組：50 mg/ kg牛血清白蛋白組（腿靜脈注射激發(fā)）；第四組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腿靜脈激發(fā)）；第五組：100 mg/kg牛血清白蛋白組（腹腔注射激發(fā)）；第六組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第12天經(jīng)腿靜脈注射激發(fā)）；第七組：50 mg/kg牛血清白蛋白組（第26天經(jīng)腿靜脈注射激發(fā)）；第八組：50 mg/ kg牛血清白蛋白經(jīng)靜脈注射激發(fā)組（1次致敏）；第九組：50 mg/kg牛血清白蛋白經(jīng)靜脈注射激發(fā)組（3次致敏）。按不同實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組情況總結(jié)如表1。

1.4 過(guò)敏反應(yīng)癥狀的觀察和嚴(yán)重程度分級(jí)

按照SFDA頒布的指導(dǎo)原則對(duì)過(guò)敏反應(yīng)嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)級(jí)（見(jiàn)表2）。按照表3所示進(jìn)行全身過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)度的評(píng)價(jià)。

表1 按不同實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分組Tab.1 Various groups with different experimental factors

表2 過(guò)敏反應(yīng)分級(jí)及癥狀Tab.2 Levels and symptoms of allergic reaction

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SAS9.0非參數(shù)檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（± s）表示。差異顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 不同致敏劑量對(duì)豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組），10 mg/kg（Ⅱ組）、50 mg/ kg（Ⅲ組）和100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）豚鼠均經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀（激發(fā)劑量：2m l/kg）；第Ⅱ組（10 mg/kg牛血清白蛋白組）5只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)弱陽(yáng)性，5只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，2只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性；第Ⅲ組（50 mg/kg牛血清白蛋白組）1只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，8只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）；第Ⅳ組（100 mg/ kg牛血清白蛋白組）3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，9只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）。具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀等級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab.3 Evaluation criteria on symptomsof systemic allergic reaction

2.2 不同激發(fā)給藥途徑對(duì)豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）、100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅳ組）經(jīng)豚鼠后腿靜脈注射激發(fā)，100 mg/kg牛血清白蛋白組（Ⅴ組）經(jīng)腹腔注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生理鹽水對(duì)照組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；第Ⅳ組3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，9只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡），過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率為100％（12/12）；第Ⅴ組豚鼠6只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陰性，6只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)弱陽(yáng)性，0只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性或者極強(qiáng)陽(yáng)性，過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率為50％（6/12）。結(jié)果見(jiàn)表5。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，相同劑量的情況下，靜脈激發(fā)給藥出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的強(qiáng)度高于腹腔注射給藥（d f=2，χ2=29.59，P＜0.05）。

表4 不同組別豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀等級(jí)評(píng)價(jià)情況Tab.4 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表5 不同組別豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀等級(jí)評(píng)價(jià)情況Tab.5 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

2.3 不同激發(fā)給藥時(shí)間對(duì)豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)的影響

以生理鹽水組（Ⅰ組）為對(duì)照組，50 mg/kg牛血清白蛋白致敏的第Ⅲ組、第Ⅵ組和第Ⅶ組豚鼠分別于致敏期結(jié)束后的第3天、第10天和第17天經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，8只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）；Ⅵ組豚鼠1只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陰性，7只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，4只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性；Ⅶ組4只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，5只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，2只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）。結(jié)果見(jiàn)表6.統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，相同劑量和相同致敏激發(fā)途徑的情況下，第Ⅲ組和第Ⅶ組過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的強(qiáng)度要高于第Ⅵ組（df=3，χ2=36.84，P＜0.05）。

2.4 不同致敏次數(shù)對(duì)豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)的影響

生理鹽水組（Ⅰ組）作為陰性對(duì)照，觀察50 mg/kg牛血清白蛋白致敏次數(shù)不同時(shí)，即Ⅲ組5次、Ⅷ組1次和Ⅸ組3次，均經(jīng)后腿靜脈注射激發(fā)時(shí)過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ組12只豚鼠均未發(fā)現(xiàn)明顯的過(guò)敏癥狀（激發(fā)劑量：2 m L/kg）；Ⅲ組1只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，8只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）；Ⅷ組豚鼠4只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陰性，6只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，2只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性；Ⅸ組3只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)陽(yáng)性，8只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)強(qiáng)陽(yáng)性，1只出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)極強(qiáng)陽(yáng)性（死亡）。結(jié)果見(jiàn)表7.統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，在相同劑量不同致敏次數(shù)的情況下，致敏3次（Ⅸ組）和5次（Ⅲ組）出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的強(qiáng)度顯著高于1次致敏組（Ⅷ組）（df=3，χ2=39.91，P＜0.05）。

3 討論

免疫毒性是指外源性化合物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的損傷作用，包括免疫抑制和免疫增強(qiáng)兩類。藥物引起的過(guò)敏反應(yīng)（超敏反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)）、自身免疫反應(yīng)以及不良免疫刺激等都屬于免疫系統(tǒng)反應(yīng)性過(guò)度增強(qiáng)所導(dǎo)致的結(jié)果［1］。根據(jù)SFDA頒布的關(guān)于化學(xué)藥物、中藥和天然藥物臨床前免疫毒性評(píng)價(jià)的技術(shù)指導(dǎo)原則，豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏反應(yīng)所檢測(cè)的藥物毒性表現(xiàn)為藥物所致的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)，由IgE介導(dǎo)。該型過(guò)敏反應(yīng)在新化合物中發(fā)生率高，在藥物的臨床副作用中比較常見(jiàn)。因此，采用敏感方法和如何評(píng)價(jià)新藥可能引起過(guò)敏反應(yīng)應(yīng)受到足夠的重視。

表6 不同組別豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀等級(jí)評(píng)價(jià)情況Tab.6 Levels on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in various groups

表7 不同組別豚鼠發(fā)生全身過(guò)敏反應(yīng)癥狀等級(jí)評(píng)價(jià)情況Tab.7 Level on symptoms of active systemic anaphylaxis of guinea pig in four groups

通過(guò)比較生理鹽水對(duì)照組和不同劑量牛血清白蛋白組（10、50、100 mg/kg）豚鼠全身過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生的情況，我們發(fā)現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率并沒(méi)有隨著劑量的增大而發(fā)生變化（均為100％），但是豚鼠過(guò)敏反應(yīng)癥狀的嚴(yán)重程度卻存在明顯的差別（見(jiàn)表4），其中兩個(gè)高劑量組50、100 mg/kg發(fā)生反應(yīng)的嚴(yán)重程度明顯高于10 mg/kg。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在新藥的安全性評(píng)價(jià)中，一定要注意受試藥物劑量的設(shè)計(jì)。劑量太低，雖然在一定范圍內(nèi)，過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率不變化，但很可能由于過(guò)敏反應(yīng)輕微，而被忽視。另外，牛血清白蛋白作為最常見(jiàn)的受試物，如果用其在實(shí)驗(yàn)方案的中作為陽(yáng)性對(duì)照物，我們推薦的適宜劑量為50 mg/kg。主要考慮如果劑量過(guò)小，作為陽(yáng)性對(duì)照難以觀察到明顯的過(guò)敏反應(yīng)；劑量過(guò)大，容易致大量動(dòng)物死亡，固然能證明實(shí)驗(yàn)體系的正確性，但失去了與實(shí)驗(yàn)組癥狀比較的意義。

根據(jù)指導(dǎo)原則，致敏過(guò)程可以采用靜脈、腹腔或皮下注射等方式，這些都是容易產(chǎn)生抗體的給藥方法。但是我們認(rèn)為多次靜脈注射致敏可造成豚鼠不必要的傷害和疼痛，一般不應(yīng)考慮。根據(jù)注射體積的差異，可以選擇腹腔和皮下致敏，由于腹腔致敏無(wú)明顯禁忌，一般可為首選。本研究發(fā)現(xiàn)，相同劑量和給藥周期的情況下，腹腔給藥大劑量激發(fā)時(shí)，豚鼠發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度明顯降低，過(guò)敏反應(yīng)很輕微，不易觀察，其原因可能為腹腔吸收較靜脈慢所致。因此，激發(fā)途徑應(yīng)嚴(yán)格為快速靜脈內(nèi)給藥。本研究還表明，激發(fā)給藥時(shí)間過(guò)短（第12天）和激發(fā)給藥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)（第26天），影響到了過(guò)敏反應(yīng)發(fā)生率和發(fā)生強(qiáng)度，這與抗體IgE產(chǎn)生與消退的時(shí)間規(guī)律相關(guān)。因此激發(fā)時(shí)間在末次致敏后第10～14天，即檢疫期結(jié)束后第19～23天較為理想。本研究中關(guān)于致敏次數(shù)的結(jié)果表明，致敏次數(shù)過(guò)少（1次），不利于抗體的產(chǎn)生，過(guò)敏反應(yīng)較弱；致敏次數(shù)太長(zhǎng)，會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)操作成本并在致敏階段引起過(guò)敏反應(yīng)，因此在藥物安全性評(píng)價(jià)中應(yīng)以3～5次為宜。

在GLP條件下進(jìn)行藥物安全性評(píng)價(jià)，使得影響豚鼠生理狀況的環(huán)境因素（如溫度、濕度、噪音、空氣等）和影響研究結(jié)果的實(shí)驗(yàn)操作因素得到了有效的控制，這在很大程度上保障了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量和評(píng)價(jià)的有效性［4-7］。盡管如此，影響豚鼠主動(dòng)全身過(guò)敏反應(yīng)的一些非實(shí)驗(yàn)因素以及操作環(huán)節(jié)仍可以影響到動(dòng)物的質(zhì)量和評(píng)價(jià)的結(jié)果。前期的研究中，我們對(duì)這些非實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。本研究是此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討指導(dǎo)原則中過(guò)敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的細(xì)節(jié)因素。研究結(jié)果表明，有必要遵照指導(dǎo)原則，注意實(shí)驗(yàn)方案中的劑量設(shè)計(jì)、激發(fā)途徑、致敏次數(shù)和時(shí)間間隔，從而有效地評(píng)價(jià)藥物可能導(dǎo)致的I型過(guò)敏反應(yīng)。

［1］霍艷，李波.藥物免疫毒性評(píng)價(jià)技術(shù)要求的國(guó)內(nèi)外進(jìn)展［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41（20）：1525-1529.

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