周燕園

(桂林醫(yī)學院，廣西桂林541004)

燙狗脊配方顆粒是狗脊飲片經(jīng)砂燙、水提、濃縮、干燥、制粒等工序制成的單味中藥配方顆粒劑［1］。狗脊為蚌殼蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz(L.)J.Sm.的干燥根莖，味苦、甘，性溫，歸肝、腎經(jīng)，具有祛風濕、補肝腎、強腰膝的功效，用于治療風濕痹痛，腰膝酸弱，下肢無力等癥［2-3］。《中國藥典》采用砂燙法對其進行炮制。砂燙使狗脊易于去毛和粉碎及有效成分的煎出，狗脊炮制后有效成分含有量增加，刺激性成分含有量降低，故狗脊炮制可起到減毒增效的雙重作用［4］。原兒茶酸和原兒茶醛是狗脊的活性成分，現(xiàn)代藥理研究證實［5-7］，原兒茶酸具有增加冠脈流量，抑制體外血小板聚集和抗菌活性，原兒茶醛具有擴張冠狀動脈，降低心肌耗氧量，抑制血小板聚集，抗腫瘤，清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化、抗炎的作用。燙狗脊活血、鎮(zhèn)痛、抗炎的藥理作用與原兒茶酸和原兒茶醛的藥理作用相吻合。根據(jù)《中國藥典》2010年版一部附錄中藥質(zhì)量標準的研究要求，本實驗參考文獻［8-13］，建立了同時測定原兒茶酸和原兒茶醛含有量的HPLC方法，為燙狗脊配方顆粒的質(zhì)量控制提供科學實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司);Agilent 8453紫外-可見分光光度計(美國安捷倫公司);BP211D電子分析天平(德國賽多利斯);LG16-W型高速離心機(北京醫(yī)用離心機廠);SB3200-T超聲清洗儀(上海必能信超聲有限公司);電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫(yī)療器械廠);SHZ-D循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限公司)。燙狗脊配方顆粒(江陰天江藥業(yè)有限公司，批號:0906059、0912104、1003085，規(guī)格:每包1 g，相當于10 g藥材飲片)，原兒茶酸對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110809-200604);原兒茶醛對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號:110810-200205);甲醇、乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為高純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流動相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(10∶90);體積流量1.0 mL/min;檢測波長258 nm;柱溫35℃。在此條件下，樣品中原兒茶酸、原兒茶醛與其它峰均能達到基線分離，陰性無干擾，見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備分別精密稱取原兒茶酸和原兒茶醛對照品適量，用50%甲醇溶解分別制成0.282，0.095 2 mg/mL的溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備取燙狗脊配方顆粒1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲60 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液離心即得。

2.2.3 陰性對照溶液的制備按處方工藝制備缺燙狗脊的陰性樣品，按2.2.2項下方法制備陰性對照溶液。

圖1 混合對照品(A)、陰性對照樣品(B)和燙狗脊配方顆粒樣品(C)HPLC色譜圖

2.3 專屬性試驗分別精密吸取原兒茶酸和原兒茶醛混合對照品溶液、陰性對照溶液和供試品溶液各10 μL，進樣分析，結(jié)果陰性對照溶液在原兒茶酸和原兒茶醛對照品保留時間處，無色譜峰，實驗表明其他成分不干擾原兒茶酸和原兒茶醛的測定。

2.4 供試品處理的正交試驗

2.4.1 因素水平的確定預(yù)試驗結(jié)果顯示，影響燙狗脊配方顆粒的主要提取工藝條件為含甲醇量、溶劑用量和超聲提取時間，因此，采用L9(34)正交設(shè)計法對這3個影響因素進行考察和優(yōu)化，樣品用量為1 g，因素水平表見表1。按正交表設(shè)計方案進行試驗，以原兒茶酸和原兒茶醛的含有量為評價指標，試驗結(jié)果見表2。

表1 提取工藝因素水平

2.4.2 最佳提取工藝的確定表2極差大小顯示，各因素影響程度依次為:A＞C＞B，由極差分析應(yīng)選擇最佳工藝為A1C2B1。由表3可知，因素A有顯著性差異，即含甲醇量對提取率有顯著性影響。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，可得出最佳提取工藝條件，即50%甲醇10倍量，超聲提取60 min。

2.4.3 驗證試驗按上述優(yōu)化的最佳條件，燙狗脊配方顆粒(批號:0906059)制備3份供試品溶液，每份1 g，進樣10 μL分析。結(jié)果樣品中的原兒茶酸、原兒茶醛的平均質(zhì)量分數(shù)分別為1.614 3 mg/g、0.684 8 mg/g，平均總質(zhì)量分數(shù)為2.299 1 mg/g，表明燙狗脊配方顆粒提取工藝穩(wěn)定可行。

表2 L9(34)正交試驗設(shè)計及結(jié)果(n=3)

表3 方差分析

2.5 線性關(guān)系考察精密吸取原兒茶酸、原兒茶醛對照品溶液1、2、4、6、8 mL分別置10 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，制成不同質(zhì)量濃度的兩種對照品溶液，所得質(zhì)量濃度標準液及原質(zhì)量濃度標準溶液各取10 μL，進樣分析。分別以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，計算得回歸方程:原兒茶酸為Y=41 365.833 5X+11.254 089，r=0.999 94;原兒茶醛為Y=16 390.286 7X－3.798 771 3，r=0.999 93。結(jié)果表明，原兒茶酸在0.028 2～0.282 mg/mL，原兒茶醛在0.009 52～0.095 2 mg/mL范圍內(nèi)，均與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗上述色譜條件下，取混合對照品溶液(原兒茶酸質(zhì)量濃度:0.17 mg/mL，原兒茶醛質(zhì)量濃度:0.078 mg/mL)，連續(xù)進樣5次，每次10 μL，記錄峰面積，計算精密度。原兒茶酸、原兒茶醛峰面積的RSD值分別為0.69%和0.58%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復性試驗精密稱取同一批號供試品(批號:0906059)，按定量測定方法操作，進行6次平行實驗，結(jié)果原兒茶酸的平均質(zhì)量分數(shù)為1.617 8 mg/g，RSD為1.26%;原兒茶醛的平均質(zhì)量分數(shù)為0.694 5 mg/g，RSD為1.58%，表明含有量測定方法重復性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液(批號:0906059)10 μL，分別于0、2、6、12、18、24 h進樣，記錄所測組分峰面積，計算原兒茶酸、原兒茶醛色譜峰面積的RSD分別為1.19%、1.83%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收試驗精密稱取已知含有量的燙狗脊配方顆粒樣品(批號:0906059)約0.5 g，6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入對照品溶液(原兒茶酸質(zhì)量濃度為0.164 mg/mL，原兒茶醛質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL)5mL，按供試品溶液方法制備，進樣10 μL，測定峰面積，計算含有量，結(jié)果原兒茶酸和原兒茶醛的平均回收率(n=6)98.45%(RSD為1.33%)及98.76%(RSD為1.51%)。結(jié)果見表4。

表4 加樣回收率測定結(jié)果(n=6)

2.10 樣品測定分別精密稱取3批號的燙狗脊配方顆粒，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄原兒茶酸和原兒茶醛的峰面積，由線性方程計算各自質(zhì)量分數(shù)，測定結(jié)果見表5。

表5 樣品中原兒茶酸和原兒茶醛測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 本研究考察了甲醇-磷酸水溶液、乙腈-磷酸水溶液流動相系統(tǒng)，以及不同磷酸的量對分離效果的影響，最后結(jié)合文獻報道［8-13］和實驗結(jié)果選擇了甲醇-0.1%磷酸溶液(10∶90)作為流動相，流動相中含有0.1%的磷酸可以使原兒茶酸和原兒茶醛得到了良好的分離，各組分色譜峰的峰形和分離度均達到要求。

3.2 經(jīng)紫外掃描，原兒茶酸在258 nm處有最大吸收峰，原兒茶醛在280 nm處有最大吸收峰，因供試品溶液在280 nm處干擾峰相對較多，原兒茶酸和原兒茶醛在258 nm處都有較好的吸收，且干擾峰較少，峰形良好，故本試驗采用258 nm的檢測波長對原兒茶酸和原兒茶醛的含有量進行準確檢測。

3.3 本實驗考察了含甲醇量、溶劑用量和超聲提取時間3個因素對燙狗脊配方顆粒中原兒茶酸與原兒茶醛提取率的影響，并進行了正交試驗。結(jié)果表明，在10倍量50%甲醇，超聲提取60 min的條件下，原兒茶酸與原兒茶醛的提取率最高。

3.4 《中國藥典》2010年版一部狗脊項下規(guī)定了原兒茶酸的檢測標準，本實驗結(jié)果表明，原兒茶酸與原兒茶醛成分的含有量可同時作為狗脊不同配方顆粒的質(zhì)量評價指標，其含有量標準尚需結(jié)合多廠家、多批次的配方顆粒含有量測定結(jié)果而定。

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