馮敬文，盧其福，沈雪梅，龍曉英*，王四元

(1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司，廣東廣州511400)

小兒清熱利肺口服液為廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司的名牌產(chǎn)品，由銀翹散和麻杏石甘湯兩個(gè)古方化裁而成。該產(chǎn)品為金銀花、連翹、牛蒡子、麻黃等十一味中藥組成的復(fù)方制劑［1］，其生產(chǎn)工藝包括水提、醇沉液混合其余分煎藥液后濃縮配劑(以下簡(jiǎn)稱濃縮配劑)等流程。鑒于不同批次口服液中活性成分含有量差異較大，因此，探討活性成分的損失原因以及減少其損失的方法是該產(chǎn)品亟待研究的重要課題。本實(shí)驗(yàn)以方中君藥與臣藥中的活性成分(綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷和鹽酸麻黃堿)為考察指標(biāo)，對(duì)這些成分在各工藝點(diǎn)的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行跟蹤，并對(duì)藥液中的鞣質(zhì)與總固形物進(jìn)行定量分析。

1 儀器、試劑與試藥

1.1 儀器高效液相色譜儀(LC-20A日本島津);紫外分光光度儀(UV-2450日本島津);十萬(wàn)分之一電子天平(Satorius BP211D);恒溫水浴鍋(HH-6宏華新佳)。

1.2 試劑與試藥綠原酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110753-200413)，鹽酸麻黃堿對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)171241-200404)，連翹苷(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):11084-200711)，牛蒡子苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):110819-200404);水質(zhì)濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院);乙腈(色譜純，迪馬公司)，鉻皮粉(分析純，上海邁坤化工公司)，磷酸(分析純)，甲醇(分析純)，三乙銨(分析純)。

小兒清熱利肺口服液(廣州潘高壽藥業(yè)股份有限公司，批號(hào):I10001、I05001A、J05001A，以下簡(jiǎn)稱“清利口服液”)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)成分測(cè)定采用高效液相色譜法測(cè)定藥液中綠原酸、鹽酸麻黃堿、連翹苷與牛蒡子苷［2-4］，具體色譜條件:DiamonsiL TM C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm);體積流量1 mL/min。①檢測(cè)綠原酸的流動(dòng)相為乙腈－0.4%磷酸水溶液(10∶90);波長(zhǎng)327 nm;柱溫30℃。②檢測(cè)鹽酸麻黃堿的流動(dòng)相乙腈－0.1%磷酸(5∶95，含0.1%三乙胺);波長(zhǎng)207 nm;柱溫25℃。③檢測(cè)連翹苷與牛蒡子苷的流動(dòng)相乙腈－0.02%磷酸溶液(23∶77);波長(zhǎng)228 nm;柱溫30℃。

2.2 鞣質(zhì)定量測(cè)定-重量法鞣質(zhì)為水溶性物質(zhì)，鉻皮粉含部分水溶性物質(zhì)，并可選擇性與鞣質(zhì)結(jié)合生成沉淀，分別測(cè)定供試藥液中的總水溶性部分、不與皮粉結(jié)合的水溶性部分和皮粉的水溶性部分，即可求得鞣質(zhì)質(zhì)量［5］。精密吸取醇沉上清液5 mL，用蒸餾水稀釋至125 mL作為供試溶液進(jìn)行測(cè)定。

2.3 固體物定量測(cè)定精密吸取藥液10 mL，按《中國(guó)藥典》2010年版附錄XA規(guī)定的浸出物測(cè)定法測(cè)定藥液中總固體物含量。

2.4 工藝過程指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率跟蹤實(shí)驗(yàn)清利口服液工藝流程主要包括提取、濃縮、醇沉、收醇濃縮、醇沉液混合其余分煎藥液后濃縮配劑(以下簡(jiǎn)稱濃縮配劑)、低溫冷藏、最終調(diào)配封裝7個(gè)工序。本實(shí)驗(yàn)以綠原酸、鹽酸麻黃堿、連翹苷及牛蒡子苷4個(gè)活性成分轉(zhuǎn)移率為跟蹤目標(biāo)(轉(zhuǎn)移率均以藥材中的含量為100%計(jì)算)，對(duì)兩個(gè)批次(I05001A、J05001A)產(chǎn)品進(jìn)行工藝跟蹤。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牛蒡子中也含有綠原酸。因此，口服液中的綠原酸為金銀花與牛蒡子中綠原酸的含有量之和。各指標(biāo)成分于關(guān)鍵工藝工程的轉(zhuǎn)移率結(jié)果見圖1。

圖1數(shù)據(jù)顯示，在提取、醇沉及濃縮配劑工藝過程三步工藝，4種活性成分轉(zhuǎn)移率顯著降低，綠原酸、連翹苷與牛蒡子苷的提取率僅為50%左右，同時(shí)，在提取工藝中，不同批次的提取率也有差異，因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)這3個(gè)關(guān)鍵工藝的成分轉(zhuǎn)移率開展了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 工藝因素對(duì)指標(biāo)成分的影響為進(jìn)一步了解各工藝因素對(duì)4個(gè)活性成分轉(zhuǎn)移率的影響，對(duì)提取溫度與時(shí)間、濃縮時(shí)間以及醇沉條件等工藝因素對(duì)指標(biāo)成分的轉(zhuǎn)移率進(jìn)行單因素考察，實(shí)驗(yàn)均平行重復(fù)三組，取平均值。將大生產(chǎn)中提取所用的溫度與時(shí)間及濃縮時(shí)間(體積)均設(shè)計(jì)在單因素考察的范圍內(nèi)。

2.5.1 提取溫度的影響稱取適量藥材，加入規(guī)定量水，分別于50、60、70、80、90、100℃的條件下單獨(dú)回流提取1 h，提取液按2.1項(xiàng)方法測(cè)定各指標(biāo)成分，以溫度為橫坐標(biāo)，藥材的轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率均以投料總藥材中的含有量為100%計(jì)算)為縱坐標(biāo)繪制轉(zhuǎn)移率-溫度關(guān)系曲線。結(jié)果見圖2。

圖2 溫度與各藥材的轉(zhuǎn)移率關(guān)系(n=3)

2.5.2 提取時(shí)間的影響稱取藥材適量，加入規(guī)定量水在100℃條件下單獨(dú)回流提取，以開始沸騰時(shí)為零時(shí)刻，分別于20、60、80、100、120 min取樣，樣品按2.1項(xiàng)方法測(cè)定各指標(biāo)成分，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，藥材的轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率均以投料總藥材中的含有量為100%計(jì)算)為縱坐標(biāo)繪制轉(zhuǎn)移率-時(shí)間關(guān)系曲線。結(jié)果見圖3。

圖2，圖3顯示，金銀花最佳提取溫度為80℃，最佳提取時(shí)間約為75 min，牛蒡子中綠原酸量隨著溫度升高與時(shí)間延長(zhǎng)而增加，綠原酸在大于60℃時(shí)遞增幅度加大，在110 min左右變化趨勢(shì)變緩。麻黃中的鹽酸麻黃堿量與溫度和時(shí)間呈正比的遞增關(guān)系，提取溫度高于70℃時(shí)，其含有量隨溫度顯著遞增。圖2顯示，提取溫度90℃時(shí)連翹苷量最高，繼續(xù)升高溫度，含有量變化不明顯;牛蒡子水提液中牛蒡子苷量隨溫度升高而增加。圖3表明，提取時(shí)間約60 min藥液中連翹苷量高，延長(zhǎng)提取時(shí)間，連翹苷量遞減;牛蒡子的最佳提取時(shí)間在100 min左右，之后隨時(shí)間增加含有量降低。

圖3 提取時(shí)間與各藥材的轉(zhuǎn)移率關(guān)系(n=3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同成分有各自的最佳提取溫度與時(shí)間?？傮w來看，溫度低，提取不完全，溫度在100℃內(nèi)，隨溫度升高，提取率增加;提取時(shí)間延長(zhǎng)到一定程度，提取量反而減少。綜合考慮，確定最佳提取溫度在100℃，提取時(shí)間控制在60～75 min內(nèi)。

2.5.3 濃縮時(shí)間的影響為進(jìn)一步說明長(zhǎng)時(shí)間的濃縮對(duì)指標(biāo)成分的影響，因此取混合藥材提取液3 000 mL于100℃進(jìn)行濃縮，分別在不同濃縮時(shí)間取樣(濃縮時(shí)間以本制劑水提液濃縮倍數(shù)為限度)，另取各指標(biāo)成分的標(biāo)準(zhǔn)品配制成已知濃度的溶液，保持溶液體積不變情況下濃縮相等時(shí)間，樣品按2.1項(xiàng)方法測(cè)定，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率均以初始總?cè)芤褐械暮辛繛?00%計(jì)算)為縱坐標(biāo)繪制轉(zhuǎn)移率-溫度關(guān)系曲線。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4。

圖4 提取液濃縮時(shí)間與各藥材的轉(zhuǎn)移率關(guān)系(n=3)

圖4顯示，水提液在濃縮過程中，藥液中各指標(biāo)成分含有量降低并不明顯，且這種變化趨勢(shì)與各對(duì)照品溶液在濃縮過程中的變化趨勢(shì)是相似的。說明各指標(biāo)成分在濃縮過程中是比較穩(wěn)定的，濃縮工藝并不是造成活性成分損失的主要原因，在工藝標(biāo)準(zhǔn)下的濃縮體積并不會(huì)造成指標(biāo)成分溶解度降低而析出。

2.5.4 醇沉條件的影響清熱利肺口服液的生產(chǎn)工藝中明確規(guī)定了醇沉工藝參數(shù)包括乙醇體積分?jǐn)?shù)、醇沉次數(shù)與放置時(shí)間，但是大生產(chǎn)發(fā)現(xiàn)，醇沉過程中攪拌方式的不同也可能造成指標(biāo)成分含有量的差異。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)攪拌方式進(jìn)行考察。

取批次J05001A濃縮液(相對(duì)密度為1.171 8)，按生產(chǎn)工藝規(guī)定的醇沉濃度、次數(shù)及時(shí)間在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行醇沉操作，以上清液中各指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率以各成分在濃縮液中的含有量為100%計(jì)算)，并以鞣質(zhì)和固形物的去除率為指標(biāo)評(píng)價(jià)醇沉效果。將實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)結(jié)果與大生產(chǎn)樣品測(cè)得結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果見表1～2。

大生產(chǎn)的醇沉操作為邊加乙醇邊進(jìn)行攪拌，待全部乙醇加入后繼續(xù)攪拌0.5 h，即可靜置沉降，靜置沉降過程中不再攪拌。實(shí)驗(yàn)室醇沉的攪拌方式與大生產(chǎn)略有不同。見表1～2。數(shù)據(jù)表明，在靜置沉降過程中加以攪拌可明顯減少各指標(biāo)成分的損失。

表1 大生產(chǎn)醇沉結(jié)果(靜置沉降過程中不攪拌)

表2 實(shí)驗(yàn)室醇沉結(jié)果(n=3)

2.5.5 濃縮配劑工藝的影響此濃縮配劑工藝過程主要是收醇濃縮液混合其它分煎液體后進(jìn)行濃縮，所得最終濃縮液再與另外分煎液配劑。在此過程中，最終濃縮液因?yàn)楹罄m(xù)配劑時(shí)間的延長(zhǎng)而使其出現(xiàn)了大量黑色沉淀物，另外后續(xù)配劑只使用最終濃縮液的上層液。

通過對(duì)此工藝過程產(chǎn)生的沉淀進(jìn)行溶解度分析，沉淀溶解于酸液，并且前工藝經(jīng)過60%醇沉，綜合考慮，推測(cè)為鞣質(zhì)。因此對(duì)最終濃縮液上層液體和沉淀進(jìn)行鞣質(zhì)的測(cè)定，結(jié)果顯示上層液中鞣質(zhì)質(zhì)量為38.88 mg/mL、沉淀中的百分比為79.76%。測(cè)定新鮮制得與放置2 d后的最終濃縮液中鹽酸麻黃堿、連翹苷、牛蒡子苷和綠原酸含量，其轉(zhuǎn)移率(轉(zhuǎn)移率以有效成分在新鮮的最終濃縮液的量為100%計(jì)算)分別為81.68%、73.22%、83.37%和83.02%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)影響指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率的三個(gè)主要工藝因素的研究表明，提取的工藝條件為100℃、60 min時(shí)各指標(biāo)成分應(yīng)有較高的轉(zhuǎn)移率，但實(shí)際生產(chǎn)跟蹤結(jié)果可得知各指標(biāo)成分顯著偏低，而且批之間存在差異，這可能與合煎過程中，特別是大生產(chǎn)藥材處于靜止?fàn)顟B(tài)，成分提取不完全、或提取過程中發(fā)生成分之間(小分子之間、小分子與大分子之間)的相互作用形成沉淀，或成分吸附于藥渣等因素有關(guān)。

而醇沉工藝，在明確醇沉濃度，次數(shù)及時(shí)間的基礎(chǔ)上，醇沉過程充分?jǐn)嚢鑼?duì)指標(biāo)成分轉(zhuǎn)移率影響較大，因?yàn)?，醇沉主要去除大分子雜質(zhì)(蛋白、淀粉、鞣質(zhì)等)，但大分子雜質(zhì)在沉淀過程中，如攪拌不勻，將造成局部含醇量過高，淀粉、蛋白質(zhì)類成分可吸附、包裹部分有效成分共同形成沉淀［6-7］，引起成分損失，但如果沉淀過程中增加攪拌，可使被包裹的有效成分重新分散于醇溶液中，增加有效成分的保留率。因?yàn)槠胶鈱?shí)驗(yàn)條件下，指標(biāo)成分綠原酸、連翹苷、牛蒡子苷與鹽酸麻黃堿在60%乙醇(工藝醇沉濃度)中的溶解度分別是在水中2.9、5.7、4.5、1.3倍，所以推測(cè)醇沉?xí)r有效成分被雜質(zhì)成分吸附包裹而損失。

結(jié)合2.5.3項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們認(rèn)為，導(dǎo)致濃縮配劑工藝過程中活性成分顯著損失的主要原因并不是濃縮工藝。在生產(chǎn)跟蹤過程中發(fā)現(xiàn)，濃縮配制工藝中的最終濃縮液由于工藝的銜接怠慢，導(dǎo)致靜置沉降中會(huì)產(chǎn)生大量黑色沉淀，靜置時(shí)間越長(zhǎng)沉淀物越多，上層藥液中的活性成分含有量越低。經(jīng)分析此黑色沉淀主要成分為鞣質(zhì)。因此，分析成分損失的原因可能與濃縮液里含有的鞣質(zhì)有關(guān)。高濃度的鞣質(zhì)與活性成分結(jié)合或自身聚合包裹活性成分自藥液中沉降出來，也是導(dǎo)致成分損失的一個(gè)重要原因。

本研究基于對(duì)產(chǎn)品的生產(chǎn)過程進(jìn)行跟蹤考察，探討了小兒清熱利肺口服液生產(chǎn)過程中質(zhì)量的動(dòng)態(tài)變化情況，研究結(jié)果對(duì)提高復(fù)方中藥口服液的質(zhì)量提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，具有一定的參考價(jià)值。

［1］易明娟，謝子清，譚億明，等.清熱利肺口服液的藥理研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1997，20(4):35-39.

［2］馮敬文，沈雪梅，王四元，等.小兒清熱利肺口服液中鹽酸麻黃堿的含量測(cè)定方法研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(5):102-104.

［3］胡燕，馮敬文，盧其福，等.小兒清熱利肺口服液中連翹苷和牛蒡子苷的含量測(cè)定方法研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26(5):497-500.

［4］魏大華，馮敬文，王四元，等.小兒清熱利肺口服液中總綠原酸的含量測(cè)定方法研究［J］.廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，26(4):373-376.

［5］時(shí)鈞，袁權(quán)，高從增.膜技術(shù)手冊(cè)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2001:137-17.

［6］陳健岳，陳健姿.中藥口服液制備工藝中應(yīng)注意的問題［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2004，15(5):274.

［7］張兆旺，孫秀梅.中藥水提醇沉淀法應(yīng)用中注意的問題［J］.山東中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，19(6):421.