李學(xué)堅(jiān)，杜正彩，鄧家剛*

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021;2.廣西中醫(yī)學(xué)院新藥研究開發(fā)中心，廣西南寧530023)

芒果苷是芒果葉Mangifera indica L.的主要活性成分，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等作用［1］，現(xiàn)有文獻(xiàn)都是采用有機(jī)溶劑提?。?-3］。作者開發(fā)了一種水基提取溶劑，結(jié)合大孔樹脂吸附和脫色技術(shù)，從芒果葉中提取高純度芒果苷，形成新的高純度芒果苷生產(chǎn)工藝，結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

美國(guó)Waters 515高效液相色譜儀，2487紫外檢測(cè)儀，威瑪龍色譜工作站。

芒果苷對(duì)照品(批號(hào)111607-200402)、磺胺甲唑(批號(hào)100025-200904)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。D101大孔樹脂(批號(hào)200811257)、D301大孔樹脂(批號(hào)200706171)，均購(gòu)自西安電力樹脂廠。95%酒精(批號(hào)20090112，食品級(jí))，購(gòu)自廣西南寧糖廠。定量測(cè)定用試劑為色譜純，水為重蒸水;其余制劑為分析純。芒果葉，經(jīng)廣西中醫(yī)學(xué)院中藥鑒定教研室林安平副教授鑒定為Mangifera indica L.的葉子。

2 方法

2.1 工藝流程鮮芒果葉→弱堿性水煮→濾去藥渣→濾液調(diào)pH值＜6→濃縮→靜置→濾取沉淀得芒果葉粗提物→強(qiáng)酸水熱溶解→靜置冷至室溫→濾取上清液→上D101柱吸附→稀醇溶液洗脫→洗脫液→上D301柱除雜質(zhì)→收集流出液→回收溶劑至少量→析出芒果苷粗品→55%乙醇回流重結(jié)晶→芒果苷產(chǎn)品。

2.2 芒果苷測(cè)定按文獻(xiàn)［4］。

3 結(jié)果

3.1 提取用水pH值的影響預(yù)試結(jié)果表明，用NaOH、KOH、Ca(OH)2、Na2CO3等無機(jī)堿調(diào)節(jié)水的pH值均可。用NaOH調(diào)節(jié)不同pH值，提取結(jié)果見表1，綜合考慮堿的用量和芒果苷的提取效率，采用pH值為9。

表1 不同pH值對(duì)提取效果的影響(n=3)

3.2 煎煮用水量的影響6等份鮮芒果葉，分別用不同倍量的pH值為9水煮沸提取1 h，時(shí)間到立即濾取煎液，調(diào)pH值為5，測(cè)定水提液中芒果苷，計(jì)算芒果苷提取率，見表2。繪制曲線圖(圖略)，拐點(diǎn)出現(xiàn)在10倍量。為保證工藝操作的穩(wěn)定性，選用12倍量。

表2 不同水量對(duì)芒果苷提取率的影響(n=3)

3.3 煎煮時(shí)間的影響5等份鮮芒果葉碎片，分別用12倍量pH值為9水煮沸0.25，0.5，1，1.5，2 h，時(shí)間到立即濾取煎液，調(diào)pH值為5，測(cè)定水提液中的芒果苷，計(jì)算芒果苷的提取率，見表3。繪制曲線圖(圖略)，拐點(diǎn)在1 h;拐點(diǎn)后提取率增加甚緩，但考慮工藝操作的穩(wěn)定性，選1.5 h。

3.4 煎煮次數(shù)的影響表3數(shù)據(jù)表明，單煮1次，芒果苷的提取率達(dá)91.47%，煮第2次意義不大。

表3 不同煎煮時(shí)間對(duì)芒果苷提取率的影響(n=3)

3.5 調(diào)節(jié)提取液pH值的影響預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，用HCl、H3PO4、H2SO4調(diào)節(jié)提取液的pH值均可。用HCl將提取液分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7，濃縮，pH3～6均可得到沉淀，且其中的芒果苷量相差不大;pH7的沉淀不明顯，溶液呈難以過濾的混懸狀。綜合生產(chǎn)成本和生產(chǎn)設(shè)備條件，選用pH值為5。

3.6 濃縮倍數(shù)的影響提取液調(diào)pH值為5后分成等體積，分別濃縮至1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3(鮮芒果葉質(zhì)量∶濃縮液體積)，放冷至室溫，靜置48 h，結(jié)果表明，1∶0.5的成稠液狀，沉淀甚少;1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶3的均有沉淀出現(xiàn)，但1∶1的因液體較黏，沉淀相對(duì)較少，母液呈混懸狀;1∶3的母液清，但沉淀較少。1∶1.5、1∶2的較好，母液和沉淀分離清楚，且得膏率相差很小，因此選1∶1.5～1∶2。

3.7 濃縮液靜置時(shí)間的影響提取液調(diào)pH值為5后，濃縮至1∶1.5(鮮芒果葉質(zhì)量∶濃縮液體積)，放冷至室溫，靜置24、36、48、60、72 h，結(jié)果表明，24～36 h，母液呈混懸狀;48 h后，沉淀明顯，母液與沉淀分層清楚。

3.8 溶解粗品用水的pH值的影響預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，用HCl、H3PO4、H2SO4調(diào)節(jié)溶解粗提物的水的pH值均可;下面選用HCl。稱取等量芒果葉粗提物，分別用100倍量的pH1、2、3、4、5、6、7的溶解用水煮沸1 h，放冷，測(cè)定水中的芒果苷。結(jié)果表明，pH1～3的水能將大部分粗提物溶解，98%以上的芒果苷溶于水中;而pH＞4的水，粗提物溶解不理想，只有少部分芒果苷溶于水中。工藝選用pH值2～3。

3.9 溶解粗提物的用水量的影響將5等份芒果苷粗提物，分別用25、50、75、100、150、200倍量的pH值為3的水煮沸1 h，靜置并冷至室溫48 h。結(jié)果表明，75倍量以下的，粗提物溶解不完全;100倍以上的，粗提物大部分溶解。工藝采用100倍量。

3.10 靜置時(shí)間及溶液溫度將芒果葉粗提物用100倍量pH值為3的水煮沸1 h，分成3等份，分別靜置24、36、48 h。結(jié)果表明，36 h以后，溶液中的固形物能很好地沉降，分層清楚。但考慮到大生產(chǎn)中降溫需要更多的時(shí)間，因此工藝采用48 h。

3.11 D101上柱體積流量的影響將D101濕法裝柱，長(zhǎng)徑比(樹脂流床高度∶柱內(nèi)直徑)為12。將芒果苷粗品用200倍量pH值為3的水煮沸1 h，靜置48 h，濾取濾液，以不同體積流量過柱，檢測(cè)流出液中開始出現(xiàn)芒果苷時(shí)的總的流出體積，見表4。繪制曲線圖(圖略)，出現(xiàn)下降的拐點(diǎn)在3 BV/h(Body volume per hour)處。出于操作的穩(wěn)定性考慮，工藝采用體積流量為2～3 BV/h。

表4 不同體積流量對(duì)D101柱吸附的影響(n=3)

3.12 D101柱洗脫體積流量的影響用70%乙醇水溶液對(duì)吸附飽和的D101柱進(jìn)行洗脫，測(cè)定洗脫液中芒果苷，計(jì)算洗下90%芒果苷時(shí)的總洗脫液體積，見表5。繪制曲線圖表明(圖略)，洗脫液體積隨洗脫速度的變大而變大，說明洗脫速度越大，洗脫效果越差，兩者呈線性關(guān)系，因此洗脫速度應(yīng)越小越好。前期試驗(yàn)結(jié)果顯示，洗脫體積流量為1BV/h時(shí)，洗脫效果很好，但會(huì)出現(xiàn)芒果苷在洗脫液中析出而影響操作的情況。因此，洗脫體積流量選擇2～3 BV/h，認(rèn)為是比較適宜的。

表5 不同洗脫體積流量對(duì)D101柱解吸附的影響(n=3)

3.13 體積流量對(duì)脫色效果的影響將等體積(5 BV)D101洗脫液，用不同的速度通過D301柱進(jìn)行脫色，然后收集全部的流出液，濃縮到0.5 BV，觀察芒果苷結(jié)晶及母液的情況。見表6。表中數(shù)據(jù)說明，流速小于4 BV時(shí)是可行的。結(jié)合洗脫體積流量，以及芒果苷粗品析出情況，建議采用2～3 BV/h。

表6 體積流量對(duì)D301柱脫色效果的影響(n=3)

3.14 D301脫色樹脂的用量不同的D101∶D301質(zhì)量比值，對(duì)料液的脫色效果有明顯影響。實(shí)驗(yàn)按不同的D101∶D301用量比例將D301樹脂裝柱，然后將等量的D101柱洗脫液通過D301柱，收集流出液，濃縮到0.5 BV，觀察芒果苷結(jié)晶情況，以及母液的情況，見表7。D101∶D301=1∶0.4～0.6時(shí)，脫色效果好，且芒果苷損失少。考慮到生產(chǎn)中脫色效果的衰退、安全系數(shù)等因素，工藝采用1∶0.5。

3.15 工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述工藝優(yōu)化結(jié)果，制訂的大生產(chǎn)工藝如下:鮮芒果葉，不用切碎，用12倍量pH值為9的NaOH水溶液煮沸1.5 h，水提液趁熱用HCl調(diào)pH值為5，濃縮至1∶1.5～1∶2(鮮芒果葉質(zhì)量∶濃縮液體積)，靜置48 h，濾過，濾餅用100倍量pH值為2～3的HCl水溶液煮沸溶解，靜置48 h，濾過，濾液上D101柱，體積流量2～3 BV/h，吸附飽和后用70%乙醇溶液洗脫，體積流量2～3 BV/h，洗脫液接著上D301柱，體積流量2～3 BV/h;收集流出液，回收乙醇，析出芒果苷粗品;粗品用100倍量的55%乙醇回流溶解，濾過，濾液回收溶劑，析出芒果苷;如此重結(jié)晶1～2次，即可得到純度不小于95%的芒果苷產(chǎn)品。工藝在廣西邦爾藥業(yè)有限公司投入工業(yè)化生產(chǎn)，其中3批見表8。

表7 D301用量對(duì)脫色效果的影響(n=3)

表8 工業(yè)化生產(chǎn)結(jié)果

4 討論

4.1 作者曾開發(fā)一種制備高純度芒果苷的工藝［3］，工藝中采用稀醇從芒果葉中提取芒果苷，采用大孔樹脂吸附去除提取液中的雜質(zhì)，最后以稀醇重結(jié)晶而獲得高純度芒果苷;文獻(xiàn)［2，5-6］也用稀乙醇從芒果葉中提取芒果苷，還用輔助手段如超聲波和微波，但尚停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。本工藝采用弱堿性水作提取溶劑，采用D101樹脂富集、D301樹脂除雜，克服了原工藝中用稀醇作提取溶媒、以及沒有富集工序的缺點(diǎn)，具有安全、環(huán)保、低成本、提取率高的特點(diǎn)。

4.2 芒果苷微溶于水［7］，作者預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明在pH值為＞4的水中不能被D101樹脂所吸附。在強(qiáng)酸性水溶液中(pH值為＜3)，一些苷類可與酸根離子形成某種形態(tài)的鹽，從而改變其理化性質(zhì)［8］，芒果苷可能也具有這種特性，因此在強(qiáng)酸溶液中被D101所吸附。

4.3 D101樹脂對(duì)中藥有效成分具有較大的吸附量和較好的吸附選擇性，但同時(shí)也對(duì)色素有很強(qiáng)的吸附作用［9］;D301樹脂在稀醇溶液中對(duì)D101樹脂所吸附的色素有較強(qiáng)的選擇性吸附作用［10］。將D101樹脂和D301樹脂聯(lián)用，富集和脫色效果都很好。

4.4 新開發(fā)的工藝可歸納為4個(gè)工序，即提取、富集、除雜、精制，每個(gè)工序有3個(gè)以上的影響因素，每個(gè)因素都影響到芒果苷的提取效率和產(chǎn)品純的度;用一張正交表很難同時(shí)對(duì)10多個(gè)影響因素進(jìn)行優(yōu)化，因此本實(shí)驗(yàn)采用單因素優(yōu)選法選擇操作參數(shù)，工業(yè)化生產(chǎn)驗(yàn)證結(jié)果表明，是可行的。

4.5 工藝已得到工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用，大批量生產(chǎn)結(jié)果表明工藝運(yùn)行穩(wěn)定、可行。

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