屈艷格，陳軍，蔡寶昌，5*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210046;2.江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029;3.南京中醫(yī)藥大學(xué)國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇南京210029;4.國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210029;5.南京海昌中藥集團(tuán)，江蘇南京210061)

馬錢子，又名番木鱉，是馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫之功效［1-2］。馬錢子中含有多種生物堿，其中馬錢子堿和士的寧為主要的活性成分和毒性成分，兩者合計(jì)在總生物堿中占70%以上。炮制后馬錢子堿和士的寧的含有量下降，二者的氮氧化物含有量升高，其中馬錢子堿氮氧化物活性很強(qiáng)但毒性遠(yuǎn)低于馬錢子堿，是炮制后減毒不減效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)［3］。臨床應(yīng)用以外用為主，口服必須炮制。傳統(tǒng)的馬錢子炮制方法有砂燙法、油炸法、烘法等，以砂燙法為主［4］，并且已經(jīng)收入《中國藥典》。由于砂燙法生產(chǎn)中受到限制，需要改革加工炮制方法，本實(shí)驗(yàn)嘗試采用烘法代替砂燙法炮制馬錢子，為馬錢子炮制工藝的現(xiàn)代化改革提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

HP 1100 Series高效液相色譜儀(美國Agilent公司);752紫外分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司);電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱DHG9076A(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);乙腈(色譜純，美國TEDIA公司);其余試劑均為分析純;馬錢子堿對照品(批號110706-200505)，士的寧對照品(批號110705-200306)，均購自中國藥品生物制品檢定所;馬錢子堿氮氧化物對照品(美國Sigma公司);馬錢子購于浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)蔡寶昌教授鑒定為馬錢科植物馬錢Strychnos nux-vomica L.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 加工炮制方法

2.1.1 砂燙馬錢子在鍋內(nèi)加入適量油砂，用電爐加熱翻炒至230℃，投入馬錢子適量，油砂掩埋并開始計(jì)時，有爆裂聲時開始翻炒，炒至3 min，此時馬錢子鼓起，爆裂并呈棕黃色，取出，放冷，即可［5］。

2.1.2 烘烤馬錢子［6］采用烘箱烘烤(溫度與時間見表1)。其中烘烤條件為加熱215℃烘烤15 min的馬錢子呈淺棕色至棕色，表面鼓起，質(zhì)地堅(jiān)脆，部分有開裂，內(nèi)表面呈棕黃色至棕褐色。

表1 不同加熱時間和溫度下馬錢子堿和士的寧測定Tab.1 Contents of brucine and strychni from Strychni Semen at different time and tempteture

2.2 馬錢子炮制品中馬錢子堿和士的寧的測定

按《中國藥典》2010年版一部方法，采用HPLC法測定馬錢子生品、砂燙制品及烘烤制品中馬錢子堿和士的寧。結(jié)果生品中含馬錢子堿1.38%，含士的寧2.02%;砂燙制品中含馬錢子堿1.04%，含士的寧1.68%。烘烤制品結(jié)果見表1。結(jié)果表明，烘烤條件為215℃烘烤10、15 min;230℃烘烤5、10、15 min;250℃烘烤5 min的馬錢子烘烤制品均符合藥典規(guī)定，并用于以下實(shí)驗(yàn)比較。

2.3 馬錢子中馬錢子堿氮氧化物的測定［7］

2.3.1 色譜條件色譜柱為Superstar C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈(A)-［水-乙酸-三乙胺(100∶0.2∶0.2)］(B);洗脫條件為0～20 min(B90%→79%)、20～50 min(B79%→60%);檢測波長254 nm;體積流量1.0 mL/min;柱溫30℃;進(jìn)樣量10 μL。

2.3.2供試品的制備精密稱取馬錢子砂燙制品和烘烤制品粉末(50目)約1 g，置50 mL錐形瓶中，加甲醇-水-濃鹽酸(25∶1∶1)27 mL溶解，稱定質(zhì)量，超聲(功率250 W，頻率20 kHz)處理30 min，取出，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足丟失的質(zhì)量，取上清液，用0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3.3 對照溶液的配制稱取馬錢子堿氮氧化物對照品適量，精密稱定，至50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為10.07 μg/mL的對照品溶液。

2.3.4 線性關(guān)系的考察精密吸取馬錢子堿氮氧化物標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇稀釋得到0.01、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣，測定峰面積。以質(zhì)量濃度(X)對峰面積(Y)作線性回歸，得到馬錢子堿氮氧化物的回歸方程為Y=27.986X－12.286(r=0.999 3)，質(zhì)量濃度范圍為1～20 μg/mL。

2.3.5 精密度試驗(yàn)取馬錢子堿氮氧化物對照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。考察發(fā)現(xiàn)馬錢子堿氮氧化物相對峰面積的RSD在0.39%。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取6份砂燙馬錢子樣品，按2.3.2項(xiàng)中供試品溶液制備方法制備，依上述條件測定，馬錢子堿氮氧化物的相對峰面積的RSD在1.97%。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)取砂燙馬錢子供試品溶液，室溫下放置，分別在0、1、4、8、12、24 h，馬錢子堿氮氧化物相對峰面積的RSD在0.58%。

2.3.8 加樣回收率試驗(yàn)取已知含有量砂燙馬錢子樣品，精密稱定，分別加入一定量的馬錢子堿氮氧化物對照品后，按2.3.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，依法測定。結(jié)果見表2。

表2 馬錢子堿氮氧化物加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery of brucine-N

2.3.9 樣品測定按2.3.2項(xiàng)下制備樣品，在所選色譜條件下測定不同處理樣品中馬錢子堿氮氧化物，結(jié)果見表3。其中烘烤條件為215℃15 min時的烘烤制品與砂燙制品中最接近。

表3 馬錢子樣品中馬錢子堿氮氧化物的含有量(與生品比較)Tab.3 Contents of brucine-N from Strychni Semen compared to the raw one

2.4 馬錢子中總生物堿的測定［8］

2.4.1 線性關(guān)系考察精密吸取經(jīng)顯色反應(yīng)后的馬錢子堿對照溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、1.0 mL，于416 nm處測定吸光度(A)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:A=3.398 6C－0.025，r=0.999 8，質(zhì)量濃度范圍為0.042 3～0.212 mg/mL。取士的寧對照溶液同法操作，得回歸方程A=3.809 5C－0.085，r=0.999 5，質(zhì)量濃度范圍為0.063 3～0.257 mg/mL。

2.4.2 精密度試驗(yàn)取樣品溶液1份，比色后連續(xù)測定6次，計(jì)算，RSD=0.88%。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品，平行操作，制備6份供試品溶液，平行比色測定，計(jì)算，RSD=0.69%。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn)取砂燙馬錢子樣品，精密稱定，分別加入馬錢子堿、士的寧對照品后，同上述條件，進(jìn)行測定。結(jié)果表明，馬錢子堿的平均回收率為98.35%，RSD=2.9%;士的寧的平均回收率為100.04%，RSD=2.7%。

2.4.5 測定方法以馬錢子堿計(jì)和士的寧計(jì)總生物堿含有量，結(jié)果見表4。結(jié)果表明烘烤條件為215℃烘烤15 min時的烘烤制品與砂燙制品中總生物堿最接近。

表4 馬錢子生品、砂燙制品和烘烤制品中總生物堿含有量Tab.4 Contents of alkaloids of the raw and processed Strychni Semen

2.5 馬錢子炮制品的聚類分析［9］

2.5.1 色譜條件、對照品溶液和供試品溶液的制備同2.3.1、2.3.2、2.3.3項(xiàng)下方法。

2.5.2 精密度試驗(yàn)取砂燙馬錢子樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，測得各色譜峰對內(nèi)參比色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在0.078%～1.821%和0.098%～2.682%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)取砂燙馬錢子樣品溶液，分別在0、1、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測得各色譜峰對內(nèi)參比色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值均小于3%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)取砂燙馬錢子樣品，平行操作，按2.3.2項(xiàng)中供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣，測得各色譜峰對內(nèi)參比色譜峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD分別在0.146%～1.665%和0.068%～1.958%，表明重復(fù)性良好。

2.5.5 共有峰的確定根據(jù)供試品溶液HPLC圖譜給出的參數(shù)，比較供試品圖譜，其中17個峰是各批供試品所共有的，因此，確定這17個峰為馬錢子炮制品的共有峰。見圖1。

圖1 馬錢子砂燙制品共有峰Fig.1 Common peaks of the Strychni Semen by stir-baked in sand

2.5.6 馬錢子炮制品指紋圖譜的聚類分析對馬錢子炮制品作指紋圖譜分析，獲得包括士的寧(13號峰)、馬錢子堿(14號峰)、馬錢子堿氮氧化物(16號峰)的17個色譜峰，用SPSS軟件作聚類分析，采用組間距離法進(jìn)行分析，利用歐氏距離作為樣品的測度。聚類譜系圖見圖2。聚類分析將馬錢子炮制品分為3類，其中烘烤條件為215℃烘烤10、15 min;230℃烘烤10、15 min烘烤制品和砂燙制品為Ⅰ類;烘烤條件為230℃烘烤5min為Ⅱ類;烘烤條件為250℃烘烤5 min為Ⅲ類。

圖2 聚類譜系圖Fig.2 Clustering pedigree chart

3 討論

3.1 烘法考察因素的選擇曾對砂燙法炮制馬錢子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)主要的影響因素為加熱溫度和時間，其他因素對其影響不大，故選擇加熱時間和溫度作為烘法的考察因素。

3.2 指紋圖譜的聚類分析從聚類譜系圖可以得出，馬錢子炮制品可分為3類。由相似度軟件計(jì)算得出，Ⅰ類烘烤制品與共有模式的相似度都在0.995～1.00之間，其中烘烤條件為加熱215℃烘烤15 min與砂燙制品特征圖譜相似度達(dá)到0.999以上;而Ⅱ類和Ⅲ類烘烤制品與共有模式的相似度在0.89、0.90，因此得到了兩種不同測度間的互相認(rèn)證。提示用烘法和砂燙法炮制馬錢子，得到的炮制品中化成成分及含有量及其接近。

3.3 通過文獻(xiàn)［10-11］研究馬錢子烘法的炮制原理與砂燙法最為接近，主要通過加熱使生物堿轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到減毒增效的目的。通常認(rèn)為馬錢子種皮上的茸毛“毒性大”“刺人咽喉”，故馬錢子一般都要求去毛［12］。馬錢子經(jīng)烘烤后，質(zhì)地堅(jiān)脆，種皮上的毛易于脫落。因烘法在日常生產(chǎn)中具有工藝穩(wěn)定，操作簡單，勞動強(qiáng)度低，重現(xiàn)性好等特點(diǎn)，故本課題擬以烘法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的砂燙法來炮制馬錢子。本課題組通過對馬錢子砂燙制品和烘烤制品中主要生物堿進(jìn)行測定，指紋圖譜的聚類分析，優(yōu)選出烘烤制品的最佳條件為加熱215℃烘烤15 min。提示用烘法和砂燙法炮制馬錢子，得到的炮制品中化學(xué)成分及含有量及其接近。由于馬錢子在臨床上具有通絡(luò)止痛，消腫散結(jié)之功效，關(guān)于馬錢子烘焙制品與砂燙制品具體對抗炎、鎮(zhèn)痛模型實(shí)驗(yàn)動物的藥理作用結(jié)果，有待日后進(jìn)一步考察。

綜上所述，烘法只需掌握溫度和時間，操作簡單容易掌握，鼓風(fēng)式加熱受熱均勻，較少受經(jīng)驗(yàn)的影響。砂燙法炮制所用的油砂粒徑不均一，傳熱程度不同;油砂的規(guī)格、干凈程度沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn);炮制過程不容易控制，炮制的重現(xiàn)性及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)受到限制。與砂燙法相比，烘法可以提高工作效率，減輕勞動強(qiáng)度，節(jié)約燃料，降低成本，既適宜于小批量加工，更適合于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，故烘法可以代替砂燙法作為馬錢子的一種炮制方法。

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