張芳，張永清*，于曉

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355;2.山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東泰安271016)

金銀花為中醫(yī)臨床最常應(yīng)用的藥物之一，具有疏散風(fēng)熱、清熱解毒的功效［1］，其來源為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花［2］。金銀花年需求量在2 000萬kg以上，為滿足需求，在山東、河南、河北等地廣泛種植，其中山東金銀花已有300余年的栽培歷史，經(jīng)過長(zhǎng)期的自然選擇與人工選擇，其植株形態(tài)出現(xiàn)了分化變異，形成了數(shù)量眾多的變異類型［3-5］。這些變異類型表現(xiàn)在產(chǎn)量和質(zhì)量上均有差異［6-7］。

金銀花化學(xué)成分復(fù)雜，其主要成分包括酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油、環(huán)烯醚萜類等［8-9］。近年來有關(guān)金銀花的質(zhì)量控制有采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定金銀花中幾種藥效成分的報(bào)道［10-12］，但同時(shí)測(cè)定的成分種類還相對(duì)較少，本實(shí)驗(yàn)采用反相-高效液相色譜法(RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定金銀花藥材中2種有機(jī)酸類(綠原酸、咖啡酸)、4種黃酮類(蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素)、1種環(huán)烯醚萜類(馬錢苷)，旨在為建立金銀花藥材質(zhì)量的多成分綜合評(píng)價(jià)體系奠定基礎(chǔ)，并且對(duì)忍冬不同變異類型花蕾質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為金銀花優(yōu)良變異類型的篩選、穩(wěn)定并提高金銀花藥材質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器、材料與試劑

1.1 儀器Agilent1200型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)，配四元梯度泵，在線脫氣機(jī)，Agilent VWD可變紫外檢測(cè)器，ChemStation色譜數(shù)據(jù)工作站。

1.2 試劑對(duì)照品綠原酸(批號(hào):110753-200413)、咖啡酸(批號(hào):110885-200102)、木犀草苷(批號(hào):111720-200905)、蘆丁(批號(hào):100080-200707)、馬錢苷(批號(hào):111640-200604)、金絲桃苷(批號(hào):111521-200303)、槲皮素(批號(hào):100081-200907)，均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。乙腈(色譜純，天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司)，磷酸(分析純，萊陽化工實(shí)驗(yàn)廠)，甲醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)。

1.3 材料山東中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園忍冬種質(zhì)資源圃中種植的5個(gè)不同變異類型，均為四年生植株，栽培管理措施一致。5個(gè)不同變異類型分別為①小毛花、②大毛花、③小雞爪、④大麻葉和⑤米花子。于2009年5月，在植株盛花期，分別采集其大白期花蕾，于室內(nèi)通風(fēng)處陰干，粉碎，置于干燥器中備用。原藥材經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)張永清教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicerae japonica Thunb.的干燥花蕾。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Aglient TC-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);采用梯度洗脫，流動(dòng)相A為0.4%磷酸水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫程序?yàn)?～18 min，A為87%;18～30 min，A為85%;30～43 min，A為85%～80%;43～48 min，A為80%;48～50 min，A為80%～70%;50～55 min，A為70%;55～65 min，A為70%～50%;檢測(cè)波長(zhǎng)為0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm;體積流量1.0 mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量20 μL。在上述色譜條件下，對(duì)照品及樣品的色譜圖見圖1。

圖1 對(duì)照品(A)及樣品(B)色譜圖Fig.1 Chromatograms of referance snbstances(A)and sample(B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備精密稱取各對(duì)照品適量，用甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為綠原酸(0.56 mg/mL)、馬錢苷(13.25 μg/mL)、咖啡酸(54 μg/mL)、蘆丁(5.7 μg/mL)、金絲桃苷(5.8 μg/mL)、木犀草苷(21.5 μg/mL)、槲皮素(3.05 μg/mL)。

2.3 樣品溶液的制備取忍冬不同變異類型花蕾細(xì)粉約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱質(zhì)量，放置6 h，超聲處理60 min，放冷，稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，以微孔濾膜(0.45 μm)濾過即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察分別精密吸取2.2項(xiàng)下對(duì)照品貯備液2、4、6、10、20、40 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸計(jì)算，得回歸方程與線性關(guān)系見表1。

表1 回歸方程與線性關(guān)系

2.5 精密度考察精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定并計(jì)算各測(cè)定成分峰面積的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明各測(cè)定成分的RSD＜3%，精密度良好。

表2 7種成分的精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性考察(n=6)

2.6 重復(fù)性考察取同一變異類型(大毛花)樣品6份各約1.0 g，精密稱定，按照2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定并計(jì)算各成分的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明RSD＜5%，方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察對(duì)變異類型2號(hào)(大毛花)的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算各成分峰面積的RSD，結(jié)果見表2。結(jié)果表明RSD＜5%，穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含有量的忍冬花蕾(大毛花)粉末6份，每份約1.0 g，分別加入適量混合對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 7種成分的回收率(n=6)

2.9 樣品測(cè)定精密稱取忍冬不同變異類型的花蕾粉末1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液。準(zhǔn)確吸取20 μL進(jìn)樣，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算各供試品中相應(yīng)成分的含有量。結(jié)果見表4。

表4 忍冬不同變異類型花蕾7種成分測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 結(jié)果與討論

3.1 提取溶劑的選擇根據(jù)各測(cè)定成分的極性和溶解性，考察了采用甲醇、乙醇及50%甲醇的提取效果及所得溶液色譜峰的分離效果，結(jié)果表明，以采用50%甲醇提取所得干擾成分少，各色譜峰的分離效果好且對(duì)各測(cè)定成分提取效率高，故選用50%甲醇作為提取溶劑。

3.2 色譜條件的優(yōu)選考察了不同梯度的乙腈－0.4%磷酸水溶液的洗脫效果，結(jié)果表明，以本實(shí)驗(yàn)所用洗脫方式分離效果最好。

［12］，綠原酸的特征吸收波長(zhǎng)為217 nm，240 nm，327 nm;蘆丁的特征吸收波長(zhǎng)為254 nm和366 nm;木犀草苷的特征吸收波長(zhǎng)為253 nm和355 nm;槲皮素的特征吸收波長(zhǎng)為254 nm和368 nm。將馬錢苷、咖啡酸、金絲桃苷單對(duì)照品分別進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)馬錢苷的特征吸收波長(zhǎng)為240 nm;咖啡酸的特征吸收波長(zhǎng)為254nm和323nm;金絲桃苷的特征吸收波長(zhǎng)為215nm，257nm，359nm?？紤]到測(cè)定時(shí)干擾峰最少，故采用如下波長(zhǎng)條件:0～16 min，240 nm;16～40 min，323 nm;40～65 min，355 nm。

3.3 忍冬5個(gè)變異類型花蕾成分比較利用所建立的色譜條件對(duì)忍冬5個(gè)不同變異類型花蕾的7種主要成分進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，所測(cè)定不同樣品中綠原酸含有量最高，其次為馬錢苷和木犀草苷，槲皮素含有量最低。

《中國(guó)藥典》(2010年版)規(guī)定，金銀花中綠原酸含有量不得低于1.5%，木犀草苷含有量不得低于0.05%。所測(cè)定5個(gè)不同變異類型綠原酸均符合《中國(guó)藥典》規(guī)定，且以大麻葉含有量(3.906 7%)最高，小毛花含有量(2.244 5%)最低;不同變異類型間木犀草苷含有量差異顯著，以大毛花(0.082 5%)最高，米花子(0.040 9%)最低，達(dá)不到藥典規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。不同變異類型間馬錢苷含有量變異范圍在0.040 9%～0.107 9%之間，且以小毛花最高，米花子最低，最高者是最低者含有量的2.6倍左右。其次，咖啡酸、蘆丁、槲皮素的含有量，不同變異類型間均差異顯著。

以上結(jié)果顯示了金銀花栽培過程中種質(zhì)優(yōu)選對(duì)于提高藥材質(zhì)量的重要性和必要性。

3.4 小結(jié)本實(shí)驗(yàn)采用RP-HPLC法同時(shí)金銀花藥材中綠原酸、咖啡酸、蘆丁、金絲桃苷、木犀草苷、槲皮素、馬錢苷7種成分，方法簡(jiǎn)便快速，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于金銀花的質(zhì)量控制。

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