魏剛，劉宏源，黃月純，謝學(xué)新，楊麗娥，劉星華，劉東輝

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405;2.廣東永生源生物科技有限公司，廣東饒平515736;3.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405)

鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo為蘭科石斛屬植物，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是藥用石斛中的上品，功能益胃生津，滋陰清熱，用于熱病津傷，口干煩渴，胃陰不足，食少干嘔，病后虛熱不退，陰虛火旺，骨蒸勞熱，目暗不明，筋骨微軟［1-2］。鐵皮石斛野生資源日趨稀少，瀕臨滅絕。鐵皮石斛組織培養(yǎng)、大田栽培的研究已取得一定的規(guī)模［3］。有研究表明，鐵皮石斛組培品與野生品在植物形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)上基本相同，總多糖含有量無顯著差異，表明鐵皮石斛經(jīng)組織培養(yǎng)和人工培植過程后藥材性狀和質(zhì)量與野生藥材相近，初步證明經(jīng)過組織培養(yǎng)快速繁殖和人工培植鐵皮石斛是解決其資源緊缺問題的有效途徑［4］。鐵皮石斛除加工成鐵皮楓斗［2］外，鮮品作為保健食品的使用也逐步擴大?，F(xiàn)代化學(xué)成分研究表明，鐵皮石斛含有多糖類、生物堿類、聯(lián)芐類衍生物、菲類化合物、黃酮類、氨基酸、微量元素等成分［3，5－6］?！吨袊幍洹?010年版鐵皮石斛的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了總多糖(≥25.0%)和甘露糖(13.0%～38.0%)的含量測定方法［2］。鑒于高效液相(HPLC)指紋圖譜在藥材質(zhì)量控制上的優(yōu)勢，殷放宙等［7］對云南思茅石膏井鎮(zhèn)的10批鐵皮石斛藥材進(jìn)行了HPLC指紋圖譜初步研究。目前，尚較少對鮮鐵皮石斛的質(zhì)量分析報道［8-9］。本實驗優(yōu)化了鐵皮石斛HPLC特征圖譜分析方法，對不同產(chǎn)地鮮品鐵皮石斛進(jìn)行特征圖譜的比較，為鮮鐵皮石斛的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

HP 1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，光二極管陣列檢測器(美國Agilent公司)。10批鮮鐵皮石斛(編號為S1～S10)由廣東饒平永生源有限公司等提供，產(chǎn)地分別為廣東、云南、浙江、廣西等地，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院黃月純主任中藥師鑒定系鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的新鮮莖。乙腈為色譜純，其它試劑為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件采用Zorbax SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱;流動相為乙腈(A)-0.2%的甲酸溶液(B)，梯度洗脫，0～20 min乙腈為0.5%→5%，20～80 min乙腈為5%→15%，80～150 min乙腈為15%→40%，150～155 min乙腈為40%→0.5%;檢測波長為270 nm;柱溫為35℃;體積流量為1.0 mL/min。

2.2 供試品溶液的制備精密稱取鮮鐵皮石斛粉末4 g，加適量硅藻土使分散，加80%甲醇50 mL，超聲處理40 min，取出，放冷，濾過，藥渣及濾紙剪碎同置于燒瓶中，加入80%甲醇50 mL，超聲處理40 min，取出，放冷，濾過，合并兩次濾液，減壓蒸干，殘渣用石油醚(60～90℃)浸泡兩次，每次5 mL(浸泡約2 min)，傾去石油醚液，殘渣加80%甲醇使溶解，置2 mL量瓶中，加80%甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗精密吸取供試品溶液10 μL，分別在0、2.5、5、10、12.5、30 h進(jìn)樣，各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明30 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗取同一批樣品6份，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，各共有峰相對保留時間與相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明重復(fù)性良好。

2.4 樣品檢測精密吸取供試品溶液10 μL，依法進(jìn)樣分析。

2.5 特征圖譜的建立與分析

2.5.1 共有峰的確定根據(jù)10批樣品分析結(jié)果，鮮鐵皮石斛主要有35個特征共有峰，以峰27為參照峰(S)分別計算各特征共有峰相對保留時間(RTR)與相對峰面積(RA)，結(jié)果峰號(平均相對保留時間、平均相對峰面積)分別為峰1(0.036、0.187)、峰2(0.079、0.090)、峰3(0.084、0.095)、峰4(0.120、0.230)、峰5(0.172、0.287)、峰6(0.192、0.105)、峰7(0.232、0.0334)、峰8(0.254、0.043)、峰9(0.296、0.028)、峰10(0.330、0.094)、峰11(0.393、0.073)、峰12(0.431、0.047)、峰13(0.485、0.032)、峰14(0.530、0.052)、峰15(0.644、0.054)、峰16(0.697、0.182)、峰17(0.772、0.082)、峰18(0.786、0.069)、峰19(0.816、0.153)、峰20(0.826、0.092)、峰21(0.843、0.066)、峰22(0.858、0.076)、峰23(0.916、0.088)、峰24(0.926、0.134)、峰25(0.944、0.180)、峰26(0.963、0.138)、峰27(1.000、1.000)、峰28(1.043、0.189)、峰29(1.065、0.140)、峰30(1.107、0.133)、峰31(1.122、0.078)、峰32(1.213、0.165±0.176)、峰33(1.235、0.070)、峰34(1.254、0.065)、峰35(1.378、0.070)。

2.5.2 相似度分析采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2004A版)，以均值法分析，以10批鮮鐵皮石斛特征圖譜生成的共有模式為對照，分析各樣品相似度，結(jié)果見表1。10批樣品HPLC特征圖譜重疊圖及共有模式見圖1～2。

表1 鮮鐵皮石斛HPLC特征圖譜相似度Tab.1 Results of similarities of HPLC characteristic spectrum of fresh Dendrobium officinale

圖1 10批鮮鐵皮石斛HPLC特征圖譜重疊圖Fig.1 HPLC characteristic spectrum overlapping of ten batches of fresh Dendrobium officinale

圖2 鮮鐵皮石斛HPLC特征圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of HPLC characteristic spectrum of fresh Dendrobium officinale

2.5.3 主要特征共有峰光譜紫外分析各特征峰的紫外光譜見圖3，主要特征峰紫外光譜分四類，峰2、峰3、峰5、峰7屬Ⅰ類，在202、265 nm附近有最大吸收;峰8、峰11、峰13、峰14屬Ⅱ類，在207、270 nm附近有最大吸收;峰18、峰19、峰21、峰22、峰23、峰24、峰29、峰31屬Ⅲ類，在200、220及280 nm附近有最大吸收;峰16、峰25、峰27屬Ⅳ類，在220、270及340 nm附近有最大吸收，為黃酮類成分。

3 討論

鐵皮石斛多糖含有量高，其他成分多而含有量低，需篩選優(yōu)化色譜條件與供試品溶液的制備方法，本研究篩選確定了分離效果較好的色譜柱(Zorbax SB-Aq C18)，流動相采用乙腈-0.2%的甲酸溶液的梯度洗脫系統(tǒng)，檢測波長在270 nm條件下檢出特征峰多。鮮鐵皮石斛含糖多、黏性很大，不易粉碎，可將樣品剪細(xì)置低溫冰箱放置后，取出及時粉碎;粉末直接加溶媒后易結(jié)塊，可先加適量硅藻土使分散;甲醇提取物含葉綠素多，可采用石油醚去脂處理。經(jīng)實驗確定了鐵皮石斛以生藥計質(zhì)量濃度為2.0 g/mL。

通過10批鮮鐵皮石斛的特征圖譜分析表明，10批樣品相似度大于0.9，表明鮮鐵皮石斛具有較強的特征指紋峰，大部分峰形尖銳，分離度好。經(jīng)紫外光譜分析，鮮鐵皮石斛主要特征峰可分為四類，其中峰17～峰27為鐵皮石斛比較專屬的特征共有峰。

圖3 鮮鐵皮石斛HPLC指紋圖譜特征峰紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectra of the main peaks of HPLC fingerprints of fresh Dendrobium officinale

研究中發(fā)現(xiàn)，絕大多數(shù)樣品的峰27為最強峰，但個別樣品的峰27較小，可能為不同種質(zhì)資源鐵皮石斛存在的差異所造成。另外，鐵皮石斛根據(jù)質(zhì)地不同有軟腳和硬腳之分，軟腳類鐵皮石斛多糖含有量較高，常加工成鐵皮楓斗，硬腳類鐵皮石斛常切斷加工成鐵皮石斛，初步研究軟腳和硬腳類鐵皮石斛基本具有類似的特征峰，不同種質(zhì)資源鐵皮石斛的區(qū)別有待于進(jìn)一步深入研究。

本實驗還對鮮鐵皮石斛組培苗進(jìn)行了初步分析，初步研究發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)資源的鐵皮石斛組培苗基本含鮮鐵皮石斛類似的特征共有峰。由于組培苗基本為葉，特征峰相對峰面積與莖有較大差異，組培苗黃酮類特征峰面積相對較大。同一種質(zhì)資源的原莖與其組培苗的特征圖譜較為相似。研究初步表明鮮鐵皮石斛HPLC特征共有峰成分能在組培苗中得到一定程度的體現(xiàn)，提示可通過分析鮮鐵皮石斛或組培苗HPLC特征圖譜優(yōu)選較佳種質(zhì)資源的原莖或組培苗。鐵皮石斛從組培苗、煉苗到入田不同生長期周期的HPLC特征圖譜相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

［1］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草:第八冊［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:711.

［2］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:265-266.

［3］高正華，楊兵勛，陳立鉆.鐵皮石斛的研究進(jìn)展［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2008，25(8):692-695.

［4］范俊安，王繼生，張艷，等.鐵皮石斛組培品與野生品的形態(tài)組織學(xué)和多糖含量比較研究［J］.中國中藥雜志，2005，30(21):1648-1650，1659.

［5］李燕，王春蘭，王芳菲，等.鐵皮石斛化學(xué)成分的研究［J］.中國中藥雜志，2010，35(35):1715-1719.

［6］管惠娟，張雪，屠鳳娟，等.鐵皮石斛化學(xué)成分的研究［J］.中草藥，2009，40(12):1873-1876.

［7］殷放宙，陸兔林，蔡寶昌，等.鐵皮石斛藥材HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2008，39(3):433-435.

［8］包雪聲，順慶生，陳立鉆，等.中國藥用石斛［M］.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社，2001:56.

［9］丁小余，王崢濤，徐紅，等.楓斗類石斛rDNA ITS區(qū)的全序列數(shù)據(jù)庫及其序列分析鑒別［J］.藥學(xué)學(xué)報，2002，37(7):567-573.