王曉嬌，郭偉英

(遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，遼寧錦州121001)

益心寧神片原方出自《金匱要略》，《傷寒論》。本方由五味子，靈芝，人參莖葉總皂苷和藤合歡組成，可補(bǔ)氣生津，養(yǎng)心安神，臨床用于心悸氣短，多夢(mèng)失眠，記憶力減退，神經(jīng)衰弱等癥。其中主要成分五味子中的木脂素成分對(duì)機(jī)體存在廣泛的作用，涉及消化系統(tǒng)，心血管系統(tǒng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)，生殖系統(tǒng)等。在對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用中，木脂素中的五味子醇甲能顯著延長(zhǎng)小鼠戊巴比妥鈉及巴比妥鈉的睡眠時(shí)間，減少小鼠自主活動(dòng)［1］。木脂素中的五味子乙素可明顯延長(zhǎng)小鼠對(duì)戊巴比妥鈉或環(huán)己巴比妥鈉的睡眠時(shí)間，而且對(duì)小鼠的睡眠時(shí)間有先延長(zhǎng)后縮短的雙向作用［2］。益心寧神片是2010年剛收入《中國(guó)藥典》的中成藥，然而，目前《中國(guó)藥典》質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中只對(duì)人參莖葉總皂苷中的成分進(jìn)行了測(cè)定。多種活性組分定量分析是中藥質(zhì)量控制的發(fā)展必然，故本實(shí)驗(yàn)建立了以高效液相色譜法測(cè)定益心寧神片中五味子醇甲和五味子乙素的方法，本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)單，便于應(yīng)用，對(duì)于進(jìn)一步提升益心寧神片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，深入研究其活性及作用機(jī)理具有重要意義。

1 儀器與試劑

1.1 儀器日立L-2000系列高效液相色譜儀;AL-204型精密電子天平［梅特勒-托利多(上海)有限公司］;KQ-100A型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑五味子醇甲對(duì)照品(批號(hào):10030202)和五味子乙素對(duì)照品(批號(hào):11050601)(成都曼斯特生物科技有限公司提供，純度≥98.0%);益心寧神片購(gòu)自本溪某藥房(批號(hào):110701，110611，110504);甲醇為市售色譜純;水為自制三蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備分別精密稱(chēng)取減壓干燥至恒質(zhì)量的五味子醇甲，五味子乙素對(duì)照品10.000 0 mg，9.999 8 mg置于5 mL量瓶中，用色譜純甲醇溶解并稀釋至刻度，定容制成含五味子醇甲，五味子乙素各2.0 mg/mL的混合對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備取本品一片，去除薄膜衣，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置于10 mL量瓶中，加色譜純甲醇溶解。密塞，超聲兩次，每次40 min，合并提取液，放冷，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，得到濃溶液后，用色譜純甲醇定容至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液備用。

2.3 陰性對(duì)照液的制備按處方比例及制備工藝制備缺五味子陰性對(duì)照品，并按2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照液。

2.4 色譜條件與方法學(xué)考察色譜柱為Hypersil BDS C18(4.6 mm×200 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水(65∶35)，體積流量為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫為40℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，五味子醇甲和五味子乙素與樣品中其他成分均達(dá)到完全分離，且與臨近色譜峰分離度＞1.5，理論塔板數(shù)按五味子醇甲和五味子乙素計(jì)算均不低于3 000，對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、益心寧神片樣品(B)及缺五味子的陰性樣品(C)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)，Yixin Ningshen Tablets(B)and negative sample without Schisandrae chinensin Frustus(C)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制配置對(duì)照品系列溶液，使混合對(duì)照品溶液中五味子醇甲和五味子乙素的質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.025 mg/mL，依次進(jìn)樣20 μL。按上述色譜條件測(cè)得各質(zhì)量濃度下的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)Y，以五味子醇甲和五味子乙素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得五味子醇甲和五味子乙素的回歸方程分別為:Y=1 102 625.000 9X－199.714 0，r=1.000 0;Y=2 635 670.830 5X+2 480 9.150 2，r=0.999 9。結(jié)果表明，五味子醇甲和五味子乙素的進(jìn)樣量在0.5～20 μg時(shí)，與峰面積呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn)精密吸取0.025 mg/mL對(duì)照品混合溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。分別計(jì)算五味子醇甲和五味子乙素峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，RSD分別為1.00%，1.37%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)(批號(hào):110701)樣品，按2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果五味子醇甲含有量的平均值為5.094 3 mg/片，RSD為1.632 2%;五味子乙素含有量的平均值為0.590 3 mg/片，RSD為1.877 1%。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)供試品溶液在0、2、4、6、8、10 h分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。五味子醇甲和五味子乙素峰面積的RSD分別為1.158 6%和1.147 2%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)分別準(zhǔn)確稱(chēng)取0.52 g已知含有量的益心寧神片藥粉(批號(hào):110701)，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，加入適量色譜純甲醇使溶解，超聲兩次，每次40 min，放冷至室溫，準(zhǔn)確加入五味子醇甲和五味子乙素標(biāo)準(zhǔn)品適量，用色譜純甲醇定容，經(jīng)(0.45 μm)濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，按上述色譜條件測(cè)定結(jié)果，計(jì)算含有量。結(jié)果五味子醇甲的平均回收率(n=6)為101.01%，RSD為1.64%;五味子乙素的平均回收率(n=6)為101.57%，RSD為2.20%?；厥章试囼?yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 五味子醇甲和五味子乙素加樣回收率結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests of schisandrin and γschisandrin(n=6)

2.10 樣品的測(cè)定按2.2項(xiàng)下方法制備3批樣品的益心寧神片供試品溶液，在上述色譜條件下測(cè)定峰面積，外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中五味子醇甲和五味子乙素的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of samples(n=3)

3 討論

3.1 本品由五味子，藤合歡，人參莖葉總皂苷和靈芝四味中藥制備而成，《中國(guó)藥典》［3］中僅對(duì)人參莖葉總皂苷中人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進(jìn)行測(cè)定，不利于多方位的控制益心寧神片的質(zhì)量。五味子(酒制)有明顯的鎮(zhèn)靜催眠作用［4］，而其中的五味子醇甲和五味子乙素的鎮(zhèn)靜催眠作用顯著。所以本實(shí)驗(yàn)選用五味子中五味子醇甲和五味子乙素作為定量指標(biāo)，用RP-HPLC法測(cè)定其含有量，結(jié)果陰性無(wú)干擾，且方法穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，專(zhuān)屬性強(qiáng)。

3.2 測(cè)定前應(yīng)注意好樣品的前處理，曾經(jīng)采用加熱回流，滲漉，超聲提取和索氏提取，對(duì)樣品進(jìn)行處理，結(jié)果表明五味子中木脂素成分以超聲提取較為完全［5-7］，且方法簡(jiǎn)單易行。本實(shí)驗(yàn)在制備供試品時(shí)曾比較不同提取溶劑(100%甲醇，70%甲醇，100%乙醇，70%乙醇)和不同提取時(shí)間(30 min、40 min、50 min)對(duì)所得含有量的影響，以100%甲醇為提取溶劑，連續(xù)兩次分別超聲提取40 min時(shí)所得含有量最大，故在此條件下提取供試品［8-11］。

3.3 本實(shí)驗(yàn)比較過(guò)不同比例流動(dòng)相(75∶25、70∶30、65∶35、60∶40)，體積流量(0.8 mL/min，1.0 mL/min)和溫度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)對(duì)出峰時(shí)間，分離度，雜質(zhì)出現(xiàn)情況和峰型的影響，最后確定使用流動(dòng)相比例為(65∶35)，1.0 mL/min，柱溫為40℃，在該條件下，各峰與雜質(zhì)峰分離良好，峰型對(duì)稱(chēng)而尖銳［12-13］。

3.4 五味子醇甲和五味子乙素在190 nm到254 nm之間均有強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，但經(jīng)比較在210 nm處時(shí)，五味子醇甲和五味子乙素的信號(hào)強(qiáng)度適中，適合同時(shí)測(cè)定。

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