劉新國，李居怡，王雄，吳金虎

(武漢市第三醫(yī)院，湖北武漢430061)

高烏甲素(Lappaconitine，又名拉巴烏頭堿或刺烏頭堿)，是從毛莨科植物高烏頭根中提取分離的生物堿，化學(xué)名稱為(1α，14α，16β)-20乙基-1，14，16-三甲氧基-烏頭烷-4，8，9-三醇-4-［2-(乙酰氨基)苯甲酸酯］，分子式是C32H44N2O8，熔點為216℃［1］。作為我國首創(chuàng)一種以鎮(zhèn)痛作用為主［2］，同時具有局麻［3-4］、降溫、解熱和抗炎消腫［5］及抗心律失常［6］等作用的非成癮性鎮(zhèn)痛藥，臨床上已有氫溴酸高烏甲素片、氫溴酸高烏甲素注射液等制劑用于晚期癌癥及術(shù)后鎮(zhèn)痛治療［7-8］。由于高烏甲素在極性溶媒中溶解度小，口服生物利用度較低，半衰期較短，將其制成經(jīng)皮給藥制劑可以避免口服給藥發(fā)生的肝臟首過效應(yīng)，避免其在胃腸道內(nèi)的破壞，降低藥物毒性和不良反應(yīng)［9-11］。而聚異丁烯作為一種新型高分子熱熔壓敏膠材料，其長鏈大分子結(jié)構(gòu)蜷曲形成獨特的基質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，對西藥和中藥均具有良好的包容性。聚異丁烯作為貼膏劑基質(zhì)具有無過敏性、不粘毛，可反復(fù)撕貼的特點，因此對該貼劑的體外釋藥與經(jīng)皮滲透行為進(jìn)行研究，不僅有助于探討聚異丁烯作為新型醫(yī)藥貼膏熱熔壓敏膠基質(zhì)可行性，同時有利于鎮(zhèn)痛藥膜控釋透皮吸收制劑的研究開發(fā)。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器TK—12B型透皮擴(kuò)散試驗儀，凱科技貿(mào)易有限公司，上海;Agilent 1200 Series四元泵高效液相色譜儀，美國;Mettler Toledo十萬分之一分析天平，德國;HS6510D超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;禹洋ZRS—8G智能溶出儀(符合《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn))。

1.2 藥品與試劑高烏甲素對照品，中國藥品生物制品檢定所，批號:100547-200401;高烏甲素貼劑，實驗室自制，分子聚合度從小到大依次為藥貼①＜藥貼②＜藥貼③;乙腈，色譜純，天津四友試劑公司生產(chǎn);水為純凈水，其他試劑均為分析純。

1.3 實驗動物健康成年雄性SD大鼠12只，廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(粵)2009-0001。

2 高烏甲素定量測定方法

2.1 色譜條件［12］Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為乙腈-水-三乙胺(200∶160∶0.5)，用磷酸調(diào)pH為8.0;體積流量1.0 mL/min;檢測波長252 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫30℃。

2.2 對照品貯備溶液制備精密稱取高烏甲素對照品適量，用甲醇制成每1 mL含高烏甲素65.8 μg的溶液，搖勻，即得。

2.3 線性關(guān)系的考察精密吸取高烏甲素對照品貯備溶液100、200、1 000、2 000、4 000、8 000 μL，用甲醇稀釋定容至10 mL，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件進(jìn)行測定。以峰面積積分值為橫坐標(biāo)(X)，高烏甲素進(jìn)樣量(ng)為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行計算，得回歸方程:Y=0.887 9X+0.378 1，r=0.999 9，表明高烏甲素在2.632～210.560 ng呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測定指標(biāo)峰峰面積，計算平均峰面積為240.907 7，RSD為1.80%，表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液10 μL，分別于0、2、6、12、24 h進(jìn)樣，測定高烏甲素色譜峰面積，計算平均質(zhì)量濃度為2.63 μg/mL，RSD為1.18%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗分別向已知量的滲透液樣品中加入一定量高烏甲素對照品溶液，用流動相加至10 mL，混勻后，精密吸取10 μL注入液相色譜儀，測定指標(biāo)峰峰面積，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算高烏甲素含有量，并計算加樣回收率。結(jié)果高烏甲素平均加樣回收率為96.32%，RSD為0.86%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果(n=9)Tab.1 Recovery test results(n=9)

3 高烏甲素貼片體外釋放度試驗

體外釋放度試驗參照2010年《中國藥典》二部附錄XD第三法。以20%乙醇-生理鹽水500 mL作為釋放介質(zhì)，預(yù)溫至(32±0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，取貼片(釋藥面積34.63 cm2)固定于自制的兩層碟片中間，釋放面向上，攪拌槳相隔(25±2)mm。立即啟動攪拌并計時，分別于1、2、4、6、8、10、12、14、16、20 h取樣3 mL，并及時補充等體積的空白釋放遞質(zhì)。釋放液用0.45μm微孔濾膜過濾，棄去初濾液，收集續(xù)濾液，進(jìn)行HPLC測定，測得高烏甲素的累積釋藥量Q［μg/(cm2)］，結(jié)果見圖1。

圖1 貼劑中高烏甲素累積釋藥量的經(jīng)時變化曲線Fig.1 The cumulative releasing curves of different lappaconitine patches

對累積釋藥量Q(μg/cm2)進(jìn)行零級、一級和Higuchi動力學(xué)方程擬合，結(jié)果見表2。

由表2結(jié)果可知:3種高烏甲素貼劑釋藥行為均以Higuchi動力學(xué)方程擬合為優(yōu)，藥物從單位面積基質(zhì)中的釋放量與時間的平方根成正比，表明3種貼劑均屬于骨架型釋藥系統(tǒng)。從3種藥貼的釋藥速率常數(shù)J可以判斷釋藥速率和完全程度藥貼①＞藥貼②＞藥貼③。

4 3種高烏甲素貼劑經(jīng)皮滲透試驗

4.1 試驗皮膚的制備取壓倒性SD大鼠12只，8%BaS腹部脫毛，飼養(yǎng)24 h，脫頸椎處死后取下腹部皮膚，仔細(xì)剝離皮下脂肪組織，并用生理鹽水沖洗至無渾濁為止，備用(皮膚用鋁箔包裹，置于低溫冰箱中保存，試驗時取出，室溫下自然解凍后使用)。

4.2 經(jīng)皮滲透試驗方法取預(yù)處理的鼠皮，將高烏甲素貼片緊貼于離體鼠皮角質(zhì)層一側(cè)，用改良的Franz擴(kuò)散池(池口面積為2.8 cm2，高為6.5 mL)的兩個半池將皮膚夾緊，角質(zhì)層面向上，將多余的皮膚剪去，固定裝置。將20%乙醇-生理鹽水加入接收池，液面與皮膚內(nèi)層接觸，保證無氣泡存在。開動電磁攪拌器恒速攪拌(200 r/min)和恒溫水浴(32±1)℃。另取一套Franz擴(kuò)散池裝置，同法操作，將不含藥物的貼劑空白基質(zhì)緊貼于離體鼠皮角質(zhì)層一側(cè)，作為空白對照。分別于規(guī)定時間取樣5 mL，再立即補充相同溫度5 mL接收液。接收液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液供HPLC測定。在測定的峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出相應(yīng)的藥物濃度，計算累積滲透量［Q，μg/cm2］，以Q～t作線性回歸，直線的斜率即為透皮速率［J，μg/(cm2·h)］，將穩(wěn)態(tài)直線推至?xí)r間軸，得滲透時滯tlag(h)。

表2 3種貼劑釋藥行為的零級、一級和Higuchi方程擬合結(jié)果Tab.2 Simulation of pharmacokinetics equation of release for lappaconitine patches

式中，Cn為第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);Ci為第i(i=n－1)個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);A為有效擴(kuò)散面積。

4.3 3種高烏甲素藥貼經(jīng)皮滲透試驗結(jié)果的比較研究按照4.2項下方法進(jìn)行透皮實驗，每種藥物貼劑平行操作4次，并對接收液中高烏甲素進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。

對累積釋藥量Q(μg/cm2)進(jìn)行零級、一級和Higuchi動力學(xué)方程擬合，結(jié)果見表3。

由表3可知，高烏甲素藥貼①在20 h內(nèi)累積透皮量顯著大于其他兩種類型貼劑(P＜0.01)，而藥貼②與藥貼③在考察時間內(nèi)累積透皮量差異較小(P＞0.05)。從3種貼劑釋藥速率與透皮速率差異的變化趨勢可以看出，基質(zhì)釋藥速率與皮膚實際透過能力差異越大，受皮膚的限速影響越強。

圖2 貼劑中高烏甲素累積透皮量的經(jīng)時變化曲線Fig.2 Cumulatively percutaneous penetration curves of different lappaconitine patches

5 討論

3種高烏甲素貼劑在20 h內(nèi)體外釋放曲線和經(jīng)皮滲透曲線均以Higuchi動力學(xué)方程擬合較好，判斷該制劑應(yīng)屬于骨架型釋藥系統(tǒng)。其累積釋藥量與累積透皮量具有因聚異丁烯分子聚合度的增加而減小的趨勢，藥物從貼劑基質(zhì)中的釋放速率均大于滲透通過皮膚的速率。3種貼劑釋藥速率與透皮速率差異的變化趨勢可以看出，基質(zhì)釋藥速率與皮膚實際透過能力差異越大，受皮膚的限速影響越強。

除高分子基質(zhì)材料的聚合度影響外，基質(zhì)藥物濃度、基質(zhì)厚度、促滲劑種類與用量等同樣會影響藥物的釋放與經(jīng)皮滲透效果。對于這一類經(jīng)皮給藥制劑的研究，應(yīng)根據(jù)考察指標(biāo)的特點選擇特異性方法進(jìn)行考察，只有把主要影響因素研究清楚了才能開發(fā)出安全長效的膜控釋經(jīng)皮給藥制劑。

表3 3種貼劑經(jīng)皮滲透行為的零級、一級和Higuchi方程擬合結(jié)果Tab.3 Transdermal permeation parameters of lappaconitine patches

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