張國強，周燕，魏玉輝，朱琳，武新安*

(1.蘭州大學第一醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000;2.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000)

茵梔黃顆粒因其保肝利膽療效顯著，臨床廣泛應用，其由茵陳、梔子、金銀花、黃芩四味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕、退黃疸和降低轉(zhuǎn)氨酶的作用［1-4］。隨著分子生物學技術的進展，近年，發(fā)現(xiàn)膽汁淤積疾病與肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Ntcp、Bsep［5］及Mrp2［6］密切相關。有研究指出，負責肝臟攝取排泄膽酸鹽的主要轉(zhuǎn)運體Ntcp和Bsep在膽管結(jié)扎大鼠模型中表達下降［7］，主要介導膽紅素及其葡糖醛酸結(jié)合物排入膽汁的Mrp2的表達也下降［8］。這些轉(zhuǎn)運體表達的下降可能是導致血清中膽酸鹽和膽紅素的升高，從而引發(fā)膽汁淤積和黃疸的主要原因。因此，本研究試圖探討茵梔黃顆粒退黃利膽的作用機制與其是否影響Ntcp、Bsep及Mrp2的表達有關。

1 材料

茵梔黃顆粒(魯南厚普制藥有限公司，生產(chǎn)批號:0805704);兔抗鼠Mrp2、Ntcp、Bsep一抗、山羊抗兔IgG、FITC熒光液(武漢博士德生物工程有限公司);PBS緩沖液(福州邁新);COULTER EPICS XL型流式細胞儀(美國貝克曼);OLYMPUS AU400全自動生化分析儀(日本OLYMPUS光學株式會社)。

2 方法

2.1 實驗動物分組與造模Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量200～250 g)15只，購于蘭州大學動物實驗中心，隨機分為3組:正常組、模型組、茵梔黃組(每組5只)。各組處理如下:

正常組:不做任何處理，自由進食飲水至實驗結(jié)束。

模型組:手術采用祝建勇［5］報道的方法，開腹，游離膽總管并以“4-0”號手術線雙重結(jié)扎，關腹即可，于造模后第2天灌胃給予生理鹽水，連續(xù)給予7 d。

茵梔黃組:手術同模型組，于造模后第2天給予茵梔黃顆粒3 g/kg，連續(xù)給藥7 d。

各組大鼠實驗干預結(jié)束后采用乙醚麻醉，腹主動脈取血2～5 mL后進行生化分析;大鼠肝臟，部分肝臟組織采用10%甲醛溶液固定，HE染色，觀察組織病變情況;部分肝組織樣品剪碎處理成細胞，采用流式細胞術分析含蛋白量。

2.2 肝臟病理切片大鼠肝臟10%甲醛溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)切片，HE染色，鏡檢觀察肝臟組織病理形態(tài)學變化。

2.3 血清生化指標檢測大鼠血液于10 000 r/min離心5 min后取血清，生化分析儀測定血清中AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶)、T-Bil(總膽紅素)、D-Bil(直接膽紅素)、I-Bil(間接膽紅素)、TBA(總膽汁酸)。

2.4 流式細胞儀測定樣品的制備新鮮的肝組織剝除肝表面薄膜及黏連組織，剪成黃豆粒大小，放入1.5 mL離心管中，加入0.1 mol/L PBS緩沖液500 μL后，剪碎，過300目尼龍網(wǎng)，1 500 r/min離心5 min，所得沉淀即為肝臟細胞，加入0.1 mol/L PBS緩沖液500 μL 500 r/min離心5 min洗滌兩次，分別加入4 mg/L的Mrp2、Ntcp和Bsep一抗20 μL，孵化30 min后，洗滌兩次，加入山羊抗兔多克隆抗體20 μL室溫孵化30 min后，洗滌兩次，再加入20 μL FITC熒光液室溫孵化30 min后，洗滌兩次，加入1 mL 0.1 mol/L PBS測定。

2.5 流式細胞儀測定條件的優(yōu)化流式細胞儀測定采用間標法，抗體Mrp2、Ntcp及Bsep的質(zhì)量濃度分別選用1、1.5、2、4、10 mg/L，室溫孵化30 min進行穩(wěn)定性考察，當一抗孵化30 min，抗體質(zhì)量濃度為4 mg/L時，平均熒光比率(Mean Fluorescence Ratio，MFR)表達最穩(wěn)定，且達到最大值，見圖1。

圖1 不同Mrp2、Ntcp、Bsep抗體質(zhì)量濃度下的平均熒光比率Fig.1 Mean fluorescence ratio under different antibody concentrations of Mrp2，Ntcp，Bsep

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0分析軟件和Microsoft Excel 2003進行統(tǒng)計分析，對大鼠肝細胞變性情況的半定量分析采用Ridit分析;對流式細胞法測定Mrp2、Ntcp、Bsep的量統(tǒng)計結(jié)果進行分析，P＜0.05或P＜0.01時表明各組數(shù)據(jù)存在差異或顯著差異，結(jié)果具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 病理切片觀察肝臟組織形態(tài)學變化見圖2。

注:1.所示區(qū)域為部分肝細胞壞死;2.所示區(qū)域為少量的毛細膽管增生;3.所示區(qū)域為肝細胞脂肪病變，導致細胞核位移;4.所示區(qū)域為肝細胞水腫，細胞核增大;5.所示區(qū)域為毛細膽管大量增生;C2.所示未見明顯肝細胞脂肪病變和水腫

參照祿保平等［9］的方法，根據(jù)實驗各組肝組織變性情況的不同，分為3級，“－”肝細胞形態(tài)和組織正常，“+”肝細胞脂肪病變及水腫輕度，未見肝細胞壞死，毛細管大量增生，“++”肝細胞脂肪病變及水腫嚴重，細胞核位移，肝細胞部分壞死，毛細管輕度增生。

根據(jù)實驗各組大鼠肝組織變性情況進行半定量分析，結(jié)果表明，正常組可見肝細胞形態(tài)正常，模型組肝組織變性嚴重，經(jīng)Ridit分析，與正常組比較有顯著的差異(P＜0.05)，而茵梔黃組與模型組一樣，膽管仍在結(jié)扎狀態(tài)，肝細胞脂肪病變及水腫明顯改善，經(jīng)Ridit分析，與模型組相比有顯著的差異(P＜0.05)，見圖2，表1。

表1 膽管結(jié)扎大鼠肝臟組織變性情況半定量分析結(jié)果(只)Tab.1 Semi-quantitative analysis of liver tissue degeneration in bile duct ligation rat

3.2 血清生化指標測定結(jié)果見表2。

表2 血液生化指標測定結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

表2 血液生化指標測定結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

注:與正常組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別生化指標AST/(U·L－1)ALT/(U·L－1)T-Bil/(mol·L－1)D-Bil/(mol·L－1)I-Bil/(mol·L－1)ALP/(U·L－1)TBA/(mol·L－1)0.2204.0±69.514.3±8.6模型組580±178.7＊＊363±199.0＊＊220±71.3＊＊100.2±42.9＊＊120±28.7＊＊717±373.3＊＊166.5±32.8＊＊茵梔黃組450±122.6#240.3±86.7#259.7±51.9126.8±23.5132.9±28.5424.0±58.6#正常組60.0±17.145.6±19.50.7±0.10.5±0.10.2±167.2±30.4

與正常組相比，模型組各指標的量明顯升高(P＜0.01);茵梔黃組與模型組相比，ALT、AST、ALP顯著下降(P＜0.05)，而T-Bil、D-Bil、I-Bil和TBA的量無顯著差異。

3.3 流式細胞儀測定肝細胞膜轉(zhuǎn)運體的MFR結(jié)果

各組肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Mrp2、Bsep及Ntcp的MFR，分別見表3、圖3、圖4和圖5，模型組與正常組相比，其Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR均顯著降低(P＜0.01)，與文獻報道的結(jié)果基本一致［7-8］。茵梔黃組與模型組相比，Mrp2的表達顯著升高(P＜0.01)(見表3、圖3)，但Bsep和Ntcp的表達無顯著差異(P＞0.05)(見表3、圖4、圖5)。

表3 各組Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

表3 各組Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

注:與正常組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

值茵梔黃組正常組9.4±1.15.9±0.79.8±0.76.7±0.8組別Mrp2值Bsep值Ntcp＊＊3.3±2.22.5±1.02.5±1.0模型組2.7±1.8＊＊2.0±0.8＊＊1.8±0.1*1.8±0.1*菌梔黃顆粒組6.7±0.8##

圖3 肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Mrp2的表達(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.3 Expression of liver membrane protein Mrp2(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

圖4 肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Bsep的表達(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.4 Expression of liver membrane protein Bsep(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

4 討論

圖5 肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Ntcp的表達(±s，n=5，*P＜0.05)Fig.5 Expression of liver membrane protein Ntcp(±s，n=5，*P＜0.05)

4.1 本實驗模型組與正常組相比，肝細胞出現(xiàn)脂肪病變和水腫、各項生化指標明顯升高、Mrp2、Bsep和Ntcp的表達顯著降低，與文獻報道的基本一致［7-8］，表明實驗中膽管結(jié)扎造模成功。

4.2 茵梔黃顆粒是臨床廣泛使用的中成藥制劑，具有退黃疸、保肝、利膽的作用，但其分子作用機制尚未闡明。本實驗期間，在大鼠膽管始終結(jié)扎、肝損傷持續(xù)發(fā)展的情況下，茵梔黃組與模型組相比，肝細胞脂肪病變和水腫有明顯的改善，血清中ALT、AST和ALP的量顯著降低，表明茵梔黃顆粒具有緩解膽管結(jié)扎大鼠肝臟持續(xù)損傷的作用。

4.3 Mrp2主要分布于肝、腎和腸中，參與有機陰離子的轉(zhuǎn)運。在肝細胞膜上Mrp2主要介導膽管側(cè)二價膽汁酸鹽、膽紅素及其葡糖醛酸結(jié)合物排入膽汁，如Mrp2表達下降則可導致血清膽紅素升高而引發(fā)黃疸［5，8，10-13］，且Mrp2基因編碼的蛋白作為膽汁流的重要推動力，其表達下調(diào)也將導致膽汁流障礙(膽汁淤積)［14］。本實驗中茵梔黃組大鼠的毛細膽管大量增生，肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Mrp2表達顯著升高，這可能是茵梔黃顆粒降低各型膽紅素和二價膽鹽在肝組織中的滯留量的作用機制之一。而位于肝細胞膜血竇面Ntcp和毛細膽管面Bsep是介導膽酸(鹽)依賴ATP進行代謝的膜糖蛋白，其負責膽酸鹽進出肝臟［5］，茵梔黃顆粒未對Ntcp和Bsep的表達產(chǎn)生影響，表明這兩個轉(zhuǎn)運體可能未參與茵梔黃顆粒的利膽作用。

4.4 茵梔黃組與模型組相比，血清中T-Bil、DBil、I-Bil和TBA的水平無顯著差異，茵梔黃組大鼠血清中的膽紅素和總膽酸鹽并沒有隨肝細胞膜轉(zhuǎn)運體Mrp2表達的增加而降低。這可能與膽管始終結(jié)扎，Mrp2沒有發(fā)揮其作用有關。

5 結(jié)論

茵梔黃顆粒能使肝臟毛細膽管大量增生，且顯著提高大鼠肝細胞Mrp2的表達，這可能是其退黃利膽的主要分子機制之一。

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