張國強(qiáng)，周燕，魏玉輝，朱琳，武新安*

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000;2.蘭州大學(xué)藥學(xué)院，甘肅蘭州730000)

茵梔黃顆粒因其保肝利膽療效顯著，臨床廣泛應(yīng)用，其由茵陳、梔子、金銀花、黃芩四味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕、退黃疸和降低轉(zhuǎn)氨酶的作用［1-4］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)展，近年，發(fā)現(xiàn)膽汁淤積疾病與肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Ntcp、Bsep［5］及Mrp2［6］密切相關(guān)。有研究指出，負(fù)責(zé)肝臟攝取排泄膽酸鹽的主要轉(zhuǎn)運(yùn)體Ntcp和Bsep在膽管結(jié)扎大鼠模型中表達(dá)下降［7］，主要介導(dǎo)膽紅素及其葡糖醛酸結(jié)合物排入膽汁的Mrp2的表達(dá)也下降［8］。這些轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的下降可能是導(dǎo)致血清中膽酸鹽和膽紅素的升高，從而引發(fā)膽汁淤積和黃疸的主要原因。因此，本研究試圖探討茵梔黃顆粒退黃利膽的作用機(jī)制與其是否影響Ntcp、Bsep及Mrp2的表達(dá)有關(guān)。

1 材料

茵梔黃顆粒(魯南厚普制藥有限公司，生產(chǎn)批號:0805704);兔抗鼠Mrp2、Ntcp、Bsep一抗、山羊抗兔IgG、FITC熒光液(武漢博士德生物工程有限公司);PBS緩沖液(福州邁新);COULTER EPICS XL型流式細(xì)胞儀(美國貝克曼);OLYMPUS AU400全自動生化分析儀(日本OLYMPUS光學(xué)株式會社)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組與造模Wistar雄性大鼠(體質(zhì)量200～250 g)15只，購于蘭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，隨機(jī)分為3組:正常組、模型組、茵梔黃組(每組5只)。各組處理如下:

正常組:不做任何處理，自由進(jìn)食飲水至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

模型組:手術(shù)采用祝建勇［5］報(bào)道的方法，開腹，游離膽總管并以“4-0”號手術(shù)線雙重結(jié)扎，關(guān)腹即可，于造模后第2天灌胃給予生理鹽水，連續(xù)給予7 d。

茵梔黃組:手術(shù)同模型組，于造模后第2天給予茵梔黃顆粒3 g/kg，連續(xù)給藥7 d。

各組大鼠實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后采用乙醚麻醉，腹主動脈取血2～5 mL后進(jìn)行生化分析;大鼠肝臟，部分肝臟組織采用10%甲醛溶液固定，HE染色，觀察組織病變情況;部分肝組織樣品剪碎處理成細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)分析含蛋白量。

2.2 肝臟病理切片大鼠肝臟10%甲醛溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)切片，HE染色，鏡檢觀察肝臟組織病理形態(tài)學(xué)變化。

2.3 血清生化指標(biāo)檢測大鼠血液于10 000 r/min離心5 min后取血清，生化分析儀測定血清中AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、ALT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶)、T-Bil(總膽紅素)、D-Bil(直接膽紅素)、I-Bil(間接膽紅素)、TBA(總膽汁酸)。

2.4 流式細(xì)胞儀測定樣品的制備新鮮的肝組織剝除肝表面薄膜及黏連組織，剪成黃豆粒大小，放入1.5 mL離心管中，加入0.1 mol/L PBS緩沖液500 μL后，剪碎，過300目尼龍網(wǎng)，1 500 r/min離心5 min，所得沉淀即為肝臟細(xì)胞，加入0.1 mol/L PBS緩沖液500 μL 500 r/min離心5 min洗滌兩次，分別加入4 mg/L的Mrp2、Ntcp和Bsep一抗20 μL，孵化30 min后，洗滌兩次，加入山羊抗兔多克隆抗體20 μL室溫孵化30 min后，洗滌兩次，再加入20 μL FITC熒光液室溫孵化30 min后，洗滌兩次，加入1 mL 0.1 mol/L PBS測定。

2.5 流式細(xì)胞儀測定條件的優(yōu)化流式細(xì)胞儀測定采用間標(biāo)法，抗體Mrp2、Ntcp及Bsep的質(zhì)量濃度分別選用1、1.5、2、4、10 mg/L，室溫孵化30 min進(jìn)行穩(wěn)定性考察，當(dāng)一抗孵化30 min，抗體質(zhì)量濃度為4 mg/L時(shí)，平均熒光比率(Mean Fluorescence Ratio，MFR)表達(dá)最穩(wěn)定，且達(dá)到最大值，見圖1。

圖1 不同Mrp2、Ntcp、Bsep抗體質(zhì)量濃度下的平均熒光比率Fig.1 Mean fluorescence ratio under different antibody concentrations of Mrp2，Ntcp，Bsep

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0分析軟件和Microsoft Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對大鼠肝細(xì)胞變性情況的半定量分析采用Ridit分析;對流式細(xì)胞法測定Mrp2、Ntcp、Bsep的量統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行分析，P＜0.05或P＜0.01時(shí)表明各組數(shù)據(jù)存在差異或顯著差異，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 病理切片觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)變化見圖2。

注:1.所示區(qū)域?yàn)椴糠指渭?xì)胞壞死;2.所示區(qū)域?yàn)樯倭康拿?xì)膽管增生;3.所示區(qū)域?yàn)楦渭?xì)胞脂肪病變，導(dǎo)致細(xì)胞核位移;4.所示區(qū)域?yàn)楦渭?xì)胞水腫，細(xì)胞核增大;5.所示區(qū)域?yàn)槊?xì)膽管大量增生;C2.所示未見明顯肝細(xì)胞脂肪病變和水腫

參照祿保平等［9］的方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組肝組織變性情況的不同，分為3級，“－”肝細(xì)胞形態(tài)和組織正常，“+”肝細(xì)胞脂肪病變及水腫輕度，未見肝細(xì)胞壞死，毛細(xì)管大量增生，“++”肝細(xì)胞脂肪病變及水腫嚴(yán)重，細(xì)胞核位移，肝細(xì)胞部分壞死，毛細(xì)管輕度增生。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組大鼠肝組織變性情況進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明，正常組可見肝細(xì)胞形態(tài)正常，模型組肝組織變性嚴(yán)重，經(jīng)Ridit分析，與正常組比較有顯著的差異(P＜0.05)，而茵梔黃組與模型組一樣，膽管仍在結(jié)扎狀態(tài)，肝細(xì)胞脂肪病變及水腫明顯改善，經(jīng)Ridit分析，與模型組相比有顯著的差異(P＜0.05)，見圖2，表1。

表1 膽管結(jié)扎大鼠肝臟組織變性情況半定量分析結(jié)果(只)Tab.1 Semi-quantitative analysis of liver tissue degeneration in bile duct ligation rat

3.2 血清生化指標(biāo)測定結(jié)果見表2。

表2 血液生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

表2 血液生化指標(biāo)測定結(jié)果(±s，n=5)Tab.2 Results of blood biochemical index(±s，n=5)

注:與正常組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別生化指標(biāo)AST/(U·L－1)ALT/(U·L－1)T-Bil/(mol·L－1)D-Bil/(mol·L－1)I-Bil/(mol·L－1)ALP/(U·L－1)TBA/(mol·L－1)0.2204.0±69.514.3±8.6模型組580±178.7＊＊363±199.0＊＊220±71.3＊＊100.2±42.9＊＊120±28.7＊＊717±373.3＊＊166.5±32.8＊＊茵梔黃組450±122.6#240.3±86.7#259.7±51.9126.8±23.5132.9±28.5424.0±58.6#正常組60.0±17.145.6±19.50.7±0.10.5±0.10.2±167.2±30.4

與正常組相比，模型組各指標(biāo)的量明顯升高(P＜0.01);茵梔黃組與模型組相比，ALT、AST、ALP顯著下降(P＜0.05)，而T-Bil、D-Bil、I-Bil和TBA的量無顯著差異。

3.3 流式細(xì)胞儀測定肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的MFR結(jié)果

各組肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2、Bsep及Ntcp的MFR，分別見表3、圖3、圖4和圖5，模型組與正常組相比，其Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR均顯著降低(P＜0.01)，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果基本一致［7-8］。茵梔黃組與模型組相比，Mrp2的表達(dá)顯著升高(P＜0.01)(見表3、圖3)，但Bsep和Ntcp的表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)(見表3、圖4、圖5)。

表3 各組Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

表3 各組Mrp2、Bsep和Ntcp的MFR值(±s，n=5)Tab.3 MFR of Mrp2，Bsep and Ntcpineach group(±s，n=5)

注:與正常組比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比，#P＜0.05，##P＜0.01。

值茵梔黃組正常組9.4±1.15.9±0.79.8±0.76.7±0.8組別Mrp2值Bsep值Ntcp＊＊3.3±2.22.5±1.02.5±1.0模型組2.7±1.8＊＊2.0±0.8＊＊1.8±0.1*1.8±0.1*菌梔黃顆粒組6.7±0.8##

圖3 肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2的表達(dá)(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.3 Expression of liver membrane protein Mrp2(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

圖4 肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Bsep的表達(dá)(±s，n=5，＊＊P＜0.01)Fig.4 Expression of liver membrane protein Bsep(±s，n=5，＊＊P＜0.01)

4 討論

圖5 肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Ntcp的表達(dá)(±s，n=5，*P＜0.05)Fig.5 Expression of liver membrane protein Ntcp(±s，n=5，*P＜0.05)

4.1 本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M與正常組相比，肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪病變和水腫、各項(xiàng)生化指標(biāo)明顯升高、Mrp2、Bsep和Ntcp的表達(dá)顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致［7-8］，表明實(shí)驗(yàn)中膽管結(jié)扎造模成功。

4.2 茵梔黃顆粒是臨床廣泛使用的中成藥制劑，具有退黃疸、保肝、利膽的作用，但其分子作用機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)期間，在大鼠膽管始終結(jié)扎、肝損傷持續(xù)發(fā)展的情況下，茵梔黃組與模型組相比，肝細(xì)胞脂肪病變和水腫有明顯的改善，血清中ALT、AST和ALP的量顯著降低，表明茵梔黃顆粒具有緩解膽管結(jié)扎大鼠肝臟持續(xù)損傷的作用。

4.3 Mrp2主要分布于肝、腎和腸中，參與有機(jī)陰離子的轉(zhuǎn)運(yùn)。在肝細(xì)胞膜上Mrp2主要介導(dǎo)膽管側(cè)二價(jià)膽汁酸鹽、膽紅素及其葡糖醛酸結(jié)合物排入膽汁，如Mrp2表達(dá)下降則可導(dǎo)致血清膽紅素升高而引發(fā)黃疸［5，8，10-13］，且Mrp2基因編碼的蛋白作為膽汁流的重要推動力，其表達(dá)下調(diào)也將導(dǎo)致膽汁流障礙(膽汁淤積)［14］。本實(shí)驗(yàn)中茵梔黃組大鼠的毛細(xì)膽管大量增生，肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2表達(dá)顯著升高，這可能是茵梔黃顆粒降低各型膽紅素和二價(jià)膽鹽在肝組織中的滯留量的作用機(jī)制之一。而位于肝細(xì)胞膜血竇面Ntcp和毛細(xì)膽管面Bsep是介導(dǎo)膽酸(鹽)依賴ATP進(jìn)行代謝的膜糖蛋白，其負(fù)責(zé)膽酸鹽進(jìn)出肝臟［5］，茵梔黃顆粒未對Ntcp和Bsep的表達(dá)產(chǎn)生影響，表明這兩個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)體可能未參與茵梔黃顆粒的利膽作用。

4.4 茵梔黃組與模型組相比，血清中T-Bil、DBil、I-Bil和TBA的水平無顯著差異，茵梔黃組大鼠血清中的膽紅素和總膽酸鹽并沒有隨肝細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)體Mrp2表達(dá)的增加而降低。這可能與膽管始終結(jié)扎，Mrp2沒有發(fā)揮其作用有關(guān)。

5 結(jié)論

茵梔黃顆粒能使肝臟毛細(xì)膽管大量增生，且顯著提高大鼠肝細(xì)胞Mrp2的表達(dá)，這可能是其退黃利膽的主要分子機(jī)制之一。

［1］郭青龍，郭殿武，陳真.茵梔黃注射液保肝作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，32(6):440-443.

［2］李責(zé)海，朱建偉，昊麗麗.茵梔黃顆粒的保肝作用研究［J］.中藥材，2001，24(5):352-355.

［3］劉延奎，單振武，徐曉光.茵梔黃顆粒的急性毒性和保肝作用研究［J］.齊魯藥事，2004，23(6):49-50.

［4］趙長普，黨中勤，李鮮.茵梔黃顆粒治療急性黃疸型肝炎的療效觀察［J］.西部醫(yī)學(xué)，2010，22(8):1497-1498.

［5］祝建勇.Stat5徑路調(diào)控膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子Ntcp和Bsep表達(dá)及促膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)研究［D］.重慶:第三軍醫(yī)大學(xué)，2006.

［6］Slitt A L，Allen K，Morrone J，et al.Regulation of transporter expression in mouse liver，kidney，and intestine during extrahepatic cholestasis［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1768(3):637-647.

［7］范然，吳碩東.肝細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸單位基因表達(dá)與膽汁瘀積的分子機(jī)制［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2003，9(9):517-519.

［8］孫進(jìn)，何仲貴.口服藥物吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2006:146-194.

［9］祿保平，彭勃，李建國.保肝解毒顆粒對雷公藤多苷致急性肝損傷小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2008，26(11):2406-2408.

［10］王蘭蘭，吳健明.臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:202-224.

［11］Ishikawa T，Müller M，Klünemann C，et al.ATP-dependent primary active transport of cysteinyl leukotrienes across liver canalicular membrane.Role of the ATP-dependent transport system for glutathione S-conjugates［J］.J Biol Chem，1990，265(31):19279-19286.

［12］Akerboom TP，Narayanaswami V，Kunst M，et al.ATP-dependentS-(2，4-dinitrophenyl)glutathione transport in canalicular plasma membrane vesicles from rat liver［J］.J Biol Chem，199l，266(20):13147-13152.

［13］Fernández-Checa J C，Takikawa H，Horie T，et al.Canalicular transport of reduced glutathione in normal and mutant Eisai hyperbilirubinemic rats［J］.J Biol Chem，1992，267(3):1667-1673.