李春楠，傅巧娟

(浙江省杭州市農業(yè)科學研究院 園藝研究所，浙江 杭州 310024)

一串紅 (Salvia splendens Ker-Gaw1)，又名鼠尾草、西洋紅、爆竹紅、撒爾維亞等，在系統(tǒng)分類上屬于唇形科 (Labiatae)鼠尾草屬 (Salvia)植物，綠化生產上常作一年生栽培。原產于南美巴西，現(xiàn)已廣泛分布于溫帶及亞熱帶地區(qū)，在我國各地廣為栽培。一串紅花瓣、花萼鮮紅艷麗，色澤純正，花序較大，花期長，在眾多草花中表現(xiàn)突出，為我國城市園林中最普遍栽培的草本花卉，是我國節(jié)日布置的傳統(tǒng)用花。而且一串紅還具有良好的藥用價值，全株均可入藥，有涼血、清熱、消腫等功效。

分子生物學是以核酸、蛋白質等生物大分子為研究對象，通過對生物大分子的結構、功能及其相互作用的運動規(guī)律的研究，從分子水平上闡明生命現(xiàn)象和本質的學科，包括基因組學、蛋白質組學等。近年來，分子生物學技術在動植物的各個領域得到了迅猛發(fā)展，在花卉的遺傳機理、性狀改良和新品種選育中發(fā)揮的作用愈加顯著。現(xiàn)階段我國花卉育種研究還很薄弱，尤其是現(xiàn)代生物技術在育種上的應用還很少，與國外發(fā)達國家相比差距很大，因此在傳統(tǒng)育種的基礎上利用現(xiàn)代生物技術尤其是利用基因工程開展草花育種研究迫在眉睫。對于一串紅來說，目前已經從栽培管理［1-3］、組織培養(yǎng)［4-6］、病 原 菌 的 分 離 鑒 定［7-8］和 活 性 物 質 提取［9-12］等基礎研究逐漸深入到分子水平上來，取得了一系列進展，現(xiàn)將分子生物學技術在一串紅中的應用情況綜述如下。

1 一串紅的遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物多樣性的重要組成部分，是生態(tài)系統(tǒng)多樣性和物種多樣性的基礎。遺傳多樣性研究主要通過分子生物學技術來進行，如隨機擴增多態(tài)性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)［13-14］、限制性片段長度多態(tài)性 (restriction fra-gment length polymorphism，RFLP)［15］、擴增片段長度多態(tài)性 (amplified fragment length polymorphism， AFLP)［16］、 單 鏈 構 象 多 態(tài) 性(single-strand conform-ation polymorphism，SSCP)［17］和相關序列擴增多態(tài)性 (sequence-related amplified polymorphism，SRAP)［18］等技術。

關于一串紅的遺傳多樣性分析已有一些報道，田曄林等［19］利用RAPD技術對已收集和自育的一串紅種質資源進行遺傳多樣性研究。以株高和花色不同為依據(jù)，選取 8個一串紅品種 (系)，對RAPD譜帶統(tǒng)計結果的聚類分析顯示，花色、株型相近的品種 (系)親緣關系較近，高株型品種(系)單獨聚為一類。胡國富等［20］探討了不同花色一串紅的親緣關系，以美國進口品種太陽神系列中的紅、紫、紅白相間、白等4種花色一串紅為試材進行了RAPD研究，結果可把4種花色一串紅劃分為2大類:紅色和紅白雙色聚為一類，然后和紫色聚在一起;白色單獨為一類。從這種劃分中可以看出，紅色和紅白雙色親緣關系較近，紫色距離紅色親緣關系較近，而白色和其他花色一串紅關系較遠，但與紅白雙色的距離較近。這些結果都表明，RAPD技術是檢測一串紅品種 (系)遺傳多樣性的有效工具。楊建玉等［21］利用 AFLP標記技術對株型突變體BN35-1、野生型BN35及4個商品種進行親緣關系分析，以確定BN35-1與BN35的親緣關系，又對北京地區(qū)常見鼠尾草屬植物的7個種23份材料進行AFLP親緣關系分析，為北京地區(qū)開展鼠尾草屬植物的種間和種內遠緣雜交提供了理論參考。然而，從目前的研究情況來看，一串紅的實驗材料品種 (系)最多只有8個，這對于了解一串紅種質資源多樣性的真實情況還遠遠不夠。為此，本課題組收集了17個一串紅品種并以此為實驗試材，對一串紅SRAP-PCR反應體系中的主要因子進行了優(yōu)化分析，建立了適合一串紅DNA的SRAPPCR擴增體系，64對引物組合中有37對引物的擴增產物在不同材料間具有明顯的多態(tài)性，其中有1對引物組合的鑒別能力最強，可將所有的17份材料完全區(qū)別開，說明SRAP能夠有效地揭示不同一串紅品種基因組間的差異，可作為一串紅品種鑒別的重要技術手段［22］。接下來利用 SRAP標記分析了這些材料的遺傳多樣性，進一步挖掘一串紅品種間遺傳基礎的多態(tài)性信息，為一串紅遺傳改良和資源創(chuàng)新提供理論基礎。

2 花色素苷相關酶和基因

植物的花朵表現(xiàn)出特定的顏色主要是花色素的積累效應，花色素的存在及其變化是植物花色表現(xiàn)的化學機制。花色素主要包括類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿［23］，其中類黃酮類色素是起主要決定作用的色素。與花色形成相關的類黃酮有兩類:一類是水溶性的花色素苷，產生的顏色范圍從紅色到紫色;另一類是黃色2-苯甲川基苯呋喃酮。花色素苷所占的比例在很大程度上能決定花的最終顏色［24］。一串紅的花瓣和花萼為紅色也是由花色素苷所決定，主要是一串紅花葵苷 (Savlinin)。經ICMS分析，在其花瓣中，一串紅花葵苷占52%，在花萼中為 50%［25］。Suzuki的實驗組［26］對一串紅花葵苷的生物合成途徑做了深入研究，發(fā)現(xiàn)丙二酰轉移酶是花葵苷形成過程的最后一個階段起催化作用的關鍵酶，包括丙二酰轉移酶Ss5MaT1和Ss5MaT2。丙二酰轉移酶Ss5MaT1是植物通用酰基轉移酶 (VPAT)家族的成員，Suzuki等［27］利用分子生物學手段對Ss5MaT1進行了研究，從一串紅花瓣中提取酶的粗提物，經過硫酸銨鹽析和多次過柱對Ss5MaT1分離純化，并克隆了它的基因Ss5MaT1。估計 Ss5MaT1單體酶的分子量為46 k Da，cDNA編碼了一個462個氨基酸的蛋白質。Suzuki等［28］又報道分離純化了一串紅花瓣中丙二酰轉移酶Ss5MaT2，并克隆了Ss5MaT2基因，全長cDNA編碼一個417個氨基酸的蛋白質，分子量46 346 Da。后 來，Li等［29］采 用 SSCP 方 法 對Ss5MaT1基因的多態(tài)性進行了研究，用RT-PCR方法從8種不同顏色一串紅中擴增了長916 bp的Ss5MaT1基因片段，測序后發(fā)現(xiàn)8種一串紅花中都存在此結構基因，而且同源性相當高，在緋紅色、干紅色、白色、紅白雙色、淺紫色、紫色中，該基因序列完全相同，僅在玫瑰紅色和鮭魚肉色兩種花色中，此基因出現(xiàn)了一個點突變，改變了編碼氨基酸的順序，在玫瑰紅色花中744 bp處的點突變導致異亮氨酸 (Ile)突變?yōu)樘K氨酸 (Thr)，而鮭魚肉色花中678 bp處的點突變導致纈氨酸 (Va1)突變成丙氨酸 (Ala)。這些基因上出現(xiàn)的點突變導致編碼氨基酸的改變是否為花色發(fā)生變化的根本原因，還有待于進一步探究。

3 存在問題及發(fā)展趨勢

在一串紅用花需求不斷增加的同時，也存在著一些問題。如市場上流行的一串紅品種退化現(xiàn)象嚴重，主要表現(xiàn)為株形衰弱、花量少、花色退變、花期長短不一、開花時間不一致;一串紅顏色比較單一，只有紅色系、白色系和紫色系等;要提高一串紅的園林利用價值，就必須創(chuàng)造出新的花色［25］;一串紅對溫度反應比較敏感，溫度超過30℃，植株生長發(fā)育受阻，花、葉變小，花瓣花萼極易脫落［30］。這些問題都嚴重影響了一串紅的觀賞價值，降低了經濟效益。因此，選育抗性較強、顏色多樣、株型美觀、開花整齊、色澤艷麗的一串紅新材料，是今后一串紅品種選育和觀賞性狀改良的主要目標。

目前對一串紅的研究還停留在基礎水平，分子生物學技術在一串紅遺傳改良和輔助育種上的應用尚淺。利用分子生物學方法有望解決一串紅花色單一、不耐高溫等問題，如利用反義RNA或共抑制技術抑制相關基因的活性。荷蘭自由大學首先用反義RNA技術 (反義的ChsA基因)改變了矮牽牛的花色，轉化株出現(xiàn)了各種深淺花斑和開白花的品種［31］，這種技術同樣可以用于一串紅的花色改良，創(chuàng)造新的花色;另外，利用植物轉基因技術提高植物抗逆性已經成為培育花卉新品種的一種趨勢，引入外源基因可定向修飾花卉的某些性狀或獲得某種能力 (如耐高溫)而不改變其他性狀，且花卉轉基因不涉及食品安全問題而比較容易被公眾所接受?，F(xiàn)在已經獲得轉基因植株的花卉有矮牽牛(Petunia)、 香 石 竹 (Dianthus)、 菊 花(Dendranthema)、百合 (Lilium)、玫瑰 (Rose)、郁金香 (Tuip)、非洲菊 (Gerbra)、金魚草(Antirrhinum majus)、絲石竹 (Gypsophila)、月季(Rosa chinensis)、石 斛 (Dedrobium)、蝦 脊 蘭(Calanthe)、草原龍膽 (Eustoma grandiflorum)、水仙 (Narcissus)、天竺葵 (Pelargonium)、唐菖蒲、安祖花 (Anthurium)、伽藍菜 (Kalanchoe laciniata)、仙客來 (Cyclamen persicum)、智利喇叭 花 (Salpiglossis sinuata)、 杜 鵑 花(Rhododendron)、向日葵 (Helianthus annus)、連翹 (Forsythia suspensa)等［32］，然而轉基因技術對一串紅的性狀改良等研究還未見報道。DNA分子標記不但可以進行品種鑒定和種質資源親緣關系分析，還可以關聯(lián)與某些農藝性狀相關的基因［33-34］，進而輔助花卉育種，縮短育種年限，分子標記關聯(lián)分析在很多花卉中已經得到成功應用［35-36］，但對于一串紅的研究，分子標記僅限于親緣關系分析和品種鑒別等方面，與觀賞性狀的關聯(lián)分析仍未見報道。

隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術將與比較基因組學和功能基因組學等學科相結合，在花卉品種鑒定、資源創(chuàng)新、輔助育種選擇等多個領域發(fā)揮越來越重要的作用。伴隨對花色素生物合成途徑的深入了解，以及過程中各種酶的結構基因和調節(jié)基因功能的進一步研究，以基因工程技術為核心的花色基因的研究，將為人為設計并創(chuàng)造花色提供了無限的可能性，展示了美好的發(fā)展前景。一串紅的分子育種工作仍處在起步階段，將基因工程、蛋白質工程等分子生物學技術應用到一串紅新品種選育中的前景非?？捎^，將有助于一串紅優(yōu)良觀賞性狀的定向選擇，使分子育種更具方向性，為一串紅資源創(chuàng)新提供輔助選擇工具和理論指導。

［1］ 王慶菊，賈大新，張長江.一串紅的品種選擇與栽培技術［J］.遼寧農業(yè)職業(yè)技術學院學報，2003，5(1):17-18.

［2］ 趙杭蘋，陳一.一串紅適地栽培技術 ［J］.黑龍江農業(yè)科學，2008(6):17.

［3］ 孫建艮，程加來，王杰，等.一串紅栽培技術 ［J］.安徽農學通報，2008，14(11):237.

［4］ 賴鐘雄，賴呈純，顏鴻偉.矮稈一串紅離體培養(yǎng)快繁技術［J］.福建農業(yè)大學學報，2001，30(4):483-485.

［5］ 李鳳蘭，胡國富，胡寶忠.8種不同花色一串紅組織培養(yǎng)快繁的研究 ［J］.生物技術，2005，15(4):71-73.

［6］ 劉輝，陳一，趙杭萍.一串紅高效離體再生體系研究 ［J］.浙江農業(yè)學報，2011，23(2):318-323.

［7］ 張麗麗，張敬澤，胡東維，等.一串紅葉斑病的病原菌鑒定［J］.菌物學報，2008，27(5):634-640.

［8］ 陳永強，李梅，牟登科，等.一串紅菌核病病原鑒定及其主要生物學特性研究 ［J］.安徽農業(yè)科學，2009，37(13):6067-6071.

［9］ Hu DP，Kawazoe K，Takaishi Y.Diterpenoids from Salvia splendens ［J］.Phytochemistry，1997，46(4):781-784.

［10］ Fontana G，Savona G，Rodriguez B.Clerodane diterpenoids from Salvia splendens ［J］.Journal of Natural Products，2006，69(12):1734-1738.

［11］ Gianfranco F，Giuseppe S， Benjamín R， et al.Synthetic studies on neoclerodane diterpenes from Salvia splendens:oxidative modifications of ring A ［J］.Tetrahedron，2009，65(8):1708-1715.

［12］ Pan Z H，Cheng J T，He J A，et al.Splendidins A-C，Three New Clerodane Diterpenoids from Salvia splendens［J］.Helvetica Chimica Acta，2011，94(3):417-422.

［13］ Welsh J，McClelland M.Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(24):7213-72l8.

［14］ Williams J G， Kubeilk A R， Livak K J， et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers ［J］.Nucleic Acids Research，1990，18(22):6531-6535.

［15］ Botstein D R，White R L，Skolnick M，et al.Construction of a geneticlinkage map in man using restriction fragment length polymorphism ［J］.Am J Hum Genet，1980，32:314-33l.

［16］ Vos P，Hogers R，Bleeker M，et a1.AFLP:a new technique for DNA fringe printing［J］.Nucleic Acids Research，1995，23(21):4407-4414.

［17］ Orita M，Iwahana H，Kanazawa H，et a1.Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single strand conformation polymorphisms ［J］.Proc Natl Acad Sci，1989，86:2766-2770.

［18］ Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455-461.

［19］ 田曄林，劉克鋒，石愛平，等.一串紅品種 (系)遺傳多樣性RADP分析 ［J］.農業(yè)生物技術科學，2006，22(5):76-78.

［20］ 胡國富，李鳳蘭，袁強，等.四種花色一串紅 RAPD分析［J］.黑龍江農業(yè)科學，2007(5):65-67.

［21］ 楊建玉，陳洪偉，劉克鋒，等.一串紅株型突變體AFLP分析 ［J］.北京農學院學報，2010，25(2):1-4.

［22］ 沈國正，李春楠，傅巧娟，等.一串紅SRAP標記的建立與品種鑒定 ［J］.浙江農業(yè)學報，2011，23(1):84-89.

［23］ Tanaka Y，Tsuda S，Kusumi T，Metabolic engineering to modify flower color ［J］.Plant Cell Physiology，1998(11):1119-1126.

［24］ 李義龍，肇濤瀾，陳立超，等.花色素苷生物合成及花色的調控 ［J］.生命科學，2008，20(1):147-152.

［25］ 李鳳蘭，劉榮梅，胡國富，等.一串紅 (Salvia splendens Ker-Gaw1)的研究進展 ［J］.東北農業(yè)大學學報，2008，39(8):131-135.

［26］ Suzuki H，Nakayama T，Nishino T.Proposed mechanism and functional amino acid residues of malonyl-CoA:Anthocyanin 5-O-Glucoside-6?-O-Malonyltransferase from flowers of Salvia splendens，a member of the versatile plant acyltransferase family［J］.Biochemistry，2003，42(6):1764-1771.

［27］ Suzuki H， Nakayama T， Yonekura-Sakakibara K， et al.Malonyl-CoA:anthocyanin 5-O-glucoside-6?-O-malonyltransferase from scarlet sage(Salvia splendens)flowers-Enzyme purification，gene cloning， expression， and characterization［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276(52):49013-49019.

［28］ Suzuki H，Sawada S，Watanabe K，et al.Identification and characterization of a novel anthocyanin malonyltransferase from scarlet sage(Salvia splendens)flowers:an enzyme that is phylogenetically separated from other anthocyanin acyltransferases ［J］.Plant J，2004，38(6):994-1003.

［29］ Li F L，Qin F F，F(xiàn)eng Y Z，et al.cDNA cloning and SSCP analysis on Ss5MaT1 gene in Salvia splendens ［J］.Journal of Food Agriculture＆ Environment，2009，7(2):581-589.

［30］ 傅巧娟，汪炳良，陳一，等.高溫脅迫對一串紅生長及葉片抗氧化酶活性的影響 ［J］.浙江農業(yè)學報，2010，22(5):628-633.

［31］ Van der Krol A R，Lenting P E，Veenstra J，et a1.An antisense chalcone synthase gene in transgenic plants inhibits flower pigmentation ［J］.Nature，1988，333:866-869.

［32］ 李鳳蘭，胡國富，胡寶忠.花色基因工程研究進展 ［J］.東北農業(yè)大學學報，2004，35(5):627-633.

［33］ 王開榮，杜穎穎，李明，等.白化茶樹特異性RAPD分子標記研究 ［J］.浙江農業(yè)科學，2007(1):50-55.

［34］ 于鳳池，姚堅，姚海根，等.花藥培養(yǎng)與分子標記輔助選擇相結合快速選育抗條紋葉枯病晚粳稻新品系的技術探討［J］.浙江農業(yè)科學，2010(4):838-840.

［35］ 劉慧民，朱玉濤，車代弟，等.繡線菊18份材料觀賞性狀與RAPD標記的關聯(lián)分析 ［J］.園藝學報，2010，37(7):1125-1131.

［36］ 施隆文，汪霞，盧佳.應用RAPD標記技術研究大花蕙蘭種質資源親緣關系 ［J］.浙江農業(yè)學報，2010，22(4):414-419.