許保磊，王 蓉

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院中心實驗室，北京老年病醫(yī)療研究中心，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京 100053)

谷氨酸是腦內(nèi)極為重要的興奮性神經(jīng)遞質之一，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中超過40%以上的突觸為谷氨酸能突觸［1］。谷氨酸能神經(jīng)元廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)，主要位于腦皮質和腦邊緣系統(tǒng)區(qū)域。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)主要的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質，但具有潛在的神經(jīng)毒性，可以導致神經(jīng)元死亡。谷氨酸從谷氨酸能神經(jīng)末梢釋放，通過與不同的谷氨酸受體結合參與信號轉導過程，同時必須從突觸間隙重新攝?。?］。胞外谷氨酸的過度蓄積和谷氨酸能受體的過度興奮增加了活性氧自由基和活性氮自由基生成，這些物質可以導致氧化應激損害，促進神經(jīng)元死亡［3］。因此，谷氨酸在胞外的濃度及其作用的時效需要精確的調(diào)節(jié)來滿足體內(nèi)的平衡，以阻止神經(jīng)元死亡。高親和力的鈉離子依賴性轉運體系統(tǒng)對腦內(nèi)谷氨酸再攝取并保持適宜濃度起主導作用。谷氨酸濃度增加和許多神經(jīng)疾病有聯(lián)系，如癲癇、卒中、神經(jīng)退行性疾病等，因此，谷氨酸轉運體的功能紊亂通常是此類疾病的起因或者是導致腦損傷的級聯(lián)反應中的重要環(huán)節(jié)。本文對谷氨酸轉運體的研究進展進行綜述，希望為開發(fā)新型神經(jīng)保護藥物開辟新的思路。

1 谷氨酸轉運體的分布、作用及轉運機制

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)傳遞遞質，通過谷氨酸受體介導中樞神經(jīng)系統(tǒng)絕大多數(shù)突觸的快速興奮性突觸傳遞，參與腦內(nèi)諸多重要生理功能。正常狀態(tài)下，谷氨酸由神經(jīng)元突觸前膜釋放，激活神經(jīng)元突觸后膜上離子型谷氨酸受體。這個過程導致鈉離子和鈣離子內(nèi)流入細胞內(nèi)，使細胞膜去極化產(chǎn)生動作電位，完成生理功能。

突觸間隙谷氨酸濃度及突觸后膜上離子型谷氨酸受體活性通過谷氨酸的釋放和清除緊密調(diào)節(jié)［4，5］。胞外谷氨酸的清除主要由谷氨酸轉運體來負責完成。目前，已分離和克隆五種谷氨酸轉運體亞型［6］。最初在大鼠腦內(nèi)發(fā)現(xiàn)并命名的轉運體有：GLAST，GLT-1和EAAC1，然后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)并命名與三者對應的人類同源體為：興奮性氨基酸轉運體1(excitatory amino acid transporter 1，EAAT1)，興奮性氨基酸轉運體2(EAAT2)和興奮性氨基酸轉運體3(EAAT3)。剩余兩個亞型，人類和嚙齒類動物共同命名為EAAT4和EAAT5。所有的轉運體均以不同的結構形式分布于各個腦組織結構中。GLAST免疫染色和蛋白表達檢測提示其主要位于小腦，而在海馬和前腦等腦組織僅少量表達。GLT-1分布和GLAST正好相反，主要在前腦表達，在小腦的表達量很小。這兩個轉運體是最重要的膠質細胞轉運體，它們主要位于膠質細胞膜或貝格曼膠質細胞興奮性突觸上。EAAT3在全腦分布，但數(shù)量均很少。EAAT4和 EAAT5主要分布于小腦和視網(wǎng)膜［4，6，7］。EAAT是一種和細胞膜綁定的類似于離子通道的轉運泵。這些轉運體在維持胞外谷氨酸濃度上扮演著重要的角色，它們維持較低的谷氨酸的生理水平，這有利于促進生物功能同時抑制興奮毒性。谷氨酸釋放到胞外后，轉運體迅速從胞外再攝取谷氨酸來保持其較低的濃度，從而適時中斷突觸傳遞［7］。谷氨酸的跨膜轉運是一個耗能過程，它需要克服巨大的濃度梯度。研究者將EAAT命名為：協(xié)同轉運子——通常用來描述一個轉運蛋白通過同向和反向協(xié)同轉運離子來完成某種物質轉運。轉運過程通過協(xié)同綁定一個底物分子，即三個鈉離子和一個氫質子到EAAT的外部構象開始，進而觸發(fā)構象級聯(lián)反應，導致EAAT構型轉變?yōu)閮?nèi)部構象，釋放底物分子，鈉離子和質子進入胞質內(nèi)。隨后，轉運體借助反向轉運鉀離子恢復外部構象，重新可以在突觸間隙接受新的底物分子［8-10］。

谷氨酸的再攝取受到多個不同機制的調(diào)控［11］。轉運蛋白表達受到環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、神經(jīng)因子、各種腦損傷反應等調(diào)節(jié)［12］。比如，垂體腺苷酸環(huán)化酶激活多肽 (pituitary adenylate cyclase-activating peptide，PACAP)是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，它可以增加膠質細胞表達GLT1［13］。轉運蛋白表達的激活可以通過磷酸化、巰基氧化、花生四烯酸等因素調(diào)控［11，12］。此外，改變轉運蛋白在細胞膜上的定位和谷氨酸轉運活化也有關系［14］。盡管所有的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的細胞類型都可以表達谷氨酸轉運體，但是星型膠質細胞是谷氨酸再攝取的最主要細胞類型［15］。星型膠質細胞的鈉依賴性轉運體最初是從大鼠腦內(nèi)克隆而來，命名為GLAST和 GLT-1。該轉運體的活性通常也可以在多個水平調(diào)節(jié)，比如蛋白表達、細胞膜的通透性、蛋白綁定、磷酸化等［16］。

2 谷氨酸介導的興奮性毒性在神經(jīng)退行性變化中的作用

神經(jīng)退行性變化是由于神經(jīng)元結構或功能的持續(xù)性丟失所致。神經(jīng)元的死亡，在某些情況下是由于觸發(fā)了某個過程導致的細胞壞死或細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)，如細胞凋亡、細胞自噬、III型細胞死亡。激發(fā)細胞死亡的過程包括蛋白降解上的缺陷、氧化應激物質產(chǎn)生、鈣失調(diào)、線粒體功能紊亂以及興奮性毒性等，這些途徑的交叉作用已經(jīng)有所報道［17］。因此，神經(jīng)元死亡更多的是一個連續(xù)性的復雜過程，某一種機制不能完整解釋神經(jīng)元的死亡。細胞凋亡的發(fā)生可能是通過半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶 (caspases)-8或 -10這一途徑刺激細胞表面死亡受體(death receptor DR)信號。另外，細胞凋亡還可能通過線粒體或內(nèi)質網(wǎng)等細胞器發(fā)出的信號觸發(fā)內(nèi)在 caspase-9相關途徑。自噬是一種細胞應激反應，能夠通過降解細胞器和蛋白質等成分實現(xiàn)細胞自身的代謝需要和某些細胞器的更新。長期激活自噬可導致細胞死亡?，F(xiàn)有研究表明，自噬實際上是一種保護性過程或從保護性轉向凋亡的變化過程，是泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)的補償機制［18］。因此，自噬可能在由聚集的錯誤折疊蛋白質所引起的神經(jīng)退行性病變中起到作用。一些神經(jīng)退行性疾病，源于某種程度的錯誤折疊蛋白的積累，包括阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈癥和肌萎縮側索硬化癥等［19］。這些錯誤折疊的蛋白可以觸發(fā)細胞應激反應和細胞死亡，從而導致神經(jīng)退行性變化。

在創(chuàng)傷、缺血性疾病以及神經(jīng)退行性疾病的病理過程中都涉及到谷氨酸介導的興奮性毒性。對谷氨酸受體的過度刺激能夠導致大量有害的結果，比如鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、增加NO產(chǎn)生、蛋白酶激活、增加細胞毒素轉錄因子和自由基等［20］。谷氨酸受體過度刺激還可導致突觸后神經(jīng)元的胞外鈣超載及多種離子失衡，加重興奮性毒性［21］。這些因素從不同機制誘發(fā)神經(jīng)元進入上述不同特點的死亡過程，加重神經(jīng)系統(tǒng)退行性變化。因此，谷氨酸介導的興奮毒性對于神經(jīng)退行性疾病具有重要的影響。

3 谷氨酸轉運體EAAT2的調(diào)節(jié)機制

EAAT2是人腦內(nèi)興奮性氨基酸轉運體中最主要的轉運蛋白，在嚙齒類動物中主要為 GLT-1，EAAT2主要在神經(jīng)膠質細胞上表達［22］。目前研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)退行性疾病病理機制中，EAAT2的功能紊亂或者降低其表達能夠顯著影響谷氨酸的再攝取，導致谷氨酸在胞外積聚及神經(jīng)元死亡，在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病比如ALS、亨廷頓氏舞蹈癥、癲癇、卒中、外傷等可見報道［23］。EAAT2在全腦和脊髓都有表達，膠質細胞上的EAAT2負責中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)90%的谷氨酸再攝取［24］。然而，在少突膠質細胞和神經(jīng)元上的EAAT2的作用目前尚不清楚。由于EAAT2在預防谷氨酸介導的興奮性毒性及維持正常腦功能中的顯著作用，研究人員開展了大量調(diào)控人EAAT-2表達的機制研究。研究發(fā)現(xiàn)，嚙齒類動物GLT-1mRNA和蛋白表達水平能夠被腫瘤壞死因子a(tumor necrosis factor-α，TNF-α)下調(diào)，而被轉化生長因子α(transforming grow th factor，TGF-a)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和環(huán)磷酸腺苷(cyclic AMP，cAMP)上調(diào)［25］。為了進一步從轉錄水平研究EAAT-2表達的調(diào)控，Su等2003年明確了人EAAT-2啟動子位點位于啟動碼上游283bp節(jié)點［26］。前期研究證實，EAAT-2在培養(yǎng)的星型膠質細胞中沒有表達，但是在與神經(jīng)細胞共同培養(yǎng)的膠質細胞中可以誘導其表達［27］。這個結果得到了進一步的模擬重現(xiàn)。用神經(jīng)細胞基質或者用cAMP、EGF、PACAP處理膠質細胞能夠誘導EAAT2的表達［26］。這些干預手段可以調(diào)控 EAAT2mRNA水平和轉錄速率［28］。通過藥理學和基因學研究發(fā)現(xiàn)，上述結果主要是通過PI3K和 NF-kB信號途徑實現(xiàn)［29］。此外，NF-kB還可以直接與 EAAT2啟動子相結合，調(diào)節(jié)其轉錄。NF-kB是一個重要的核轉錄活化因子，它不僅僅能激活 EAAT2mRNA的表達，而且在某些因素作用下還可以抑制EAAT2mRNA的表達［28］。

4 藥物對谷氨酸轉運體 EAAT2調(diào)節(jié)影響的體內(nèi)外實驗

目前，有15種FDA批準的β-內(nèi)酰胺類抗生素在老鼠的脊髓切片實驗中證實能夠提高EAAT2的活性和其蛋白水平。體外實驗中，熒光素標記人EAAT2啟動子轉染到初級胎兒膠質細胞(primary human fetal astrocytes，PHFA)，給予多種化合物處理，可以觀察到頭孢曲松鈉(ceftriaxone，CEF)、阿莫西林等能夠提高EAAT2活性和蛋白水平，而谷氨酸和甘氨酸是無效的［30］。同時實驗結果提示 PHFA模型可以作為篩選選擇性上調(diào)EAAT2啟動子活性化合物的適宜模型。體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，頭孢曲松鈉能夠提高大鼠腦內(nèi) GLT1轉運蛋白表達［30］。CEF在低氧低糖(oxygen glucose deprivation，OGD)模擬缺血環(huán)境下，具有神經(jīng)保護作用，其機制源于CEF能夠增強EAAT2蛋白表達和轉運活性［31］。CEF還能夠降低谷氨酸轉運體抑制劑(threo-hydroxyaspartate，THA)誘導的脊髓運動神經(jīng)元丟失。此外，CEF可以延緩神經(jīng)退行性疾病動物模型G37A SOD1大鼠的肌肉力量及體重下降［30］。NF-kB信號通路對于頭孢曲松鈉(CEF)導致的EAAT2表達上調(diào)具有主要作用。NF-kB綁定于 272位點是 CEF介導的EAAT2蛋白誘導的關鍵步驟［32］。

研究者進一步篩選了能夠潛在調(diào)節(jié)谷氨酸水平的藥物。有研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)對膠質細胞中EAAT2表達具有潛在調(diào)節(jié)作用［33］。在培養(yǎng)膠質細胞介質中加入EGF和胰島素，提高了絲/蘇氨酸激酶(serine threonine kinase Akt1)和 mTOR的磷酸化水平及EAAT2蛋白表達。給予Akt1抑制劑處理后，能夠下調(diào)m TOR的磷酸化水平及EAAT2蛋白表達。然而，給予 m TOR抑制劑干預，可以降低EAAT2表達，但并不影響 Akt1磷酸化水平。所以，作用于雷帕霉素靶蛋白信號通路藥物能夠上調(diào)EAAT2表達。Wu等研究了乙醇作用于膠質細胞時，平衡 型 核 苷轉 運 體 1(equilibrative nucleoside transporter，ENT1)和 EAAT2之間的作用關系［34］。ENT1是已知調(diào)節(jié)乙醇在腦內(nèi)影響的重要因素之一。ENT1特定抑制劑和siRNA技術共同干預能夠導致膠質細胞EAAT2表達和谷氨酸攝取下降。予以100mM乙醇治療后提高了EAAT2的表達和谷氨酸轉運活性。乙醇導致的EAAT2mRNA水平增加能夠被ENT1特定siRNA處理抑制，所以，ENT1在乙醇調(diào)節(jié)EAAT2表達的過程中起到關鍵作用。此外，有學者報道，cAMP信號通路在乙醇對膠質細胞內(nèi)EAAT2表達中發(fā)揮作用［35］。因此，雷帕霉素和乙醇等化合物通過調(diào)節(jié)EAAT2表達在神經(jīng)變性病領域具有潛在的治療機會。

綜上所述，EAAT2轉錄調(diào)節(jié)和保持胞外谷氨酸低水平在神經(jīng)退行性疾病中具有重要作用［36］，因此使用EAAT2啟動子的篩選模式來篩選驗證在動物體內(nèi)合理安全的調(diào)節(jié)谷氨酸水平的分子，進而應用到人體，是一個全新的切入點，由此來開發(fā)新的通過控制突觸間隙谷氨酸水平的神經(jīng)保護新藥。此外，通過化學建模，有可能開發(fā)出新的CEF的衍生物，增強其藥理和生物活性，使其更容易通過血腦屏障，提高對神經(jīng)退行性疾病的治療作用。

［1］Fairman WA，Amara SG.Functional diversity of excitatory amino acid transporters：ion channel and transport modes［J］.Am J Physiol，1999，277(4)：481-486.

［2］Kanai Y，Hediger MA.The glutamate and neutral amino acid transporter fam ily：physiological and pharmacological implications［J］.Eur J Pharmacol，2003，479(1-3)：237-247.

［3］Ganel R，Rothstein JD.In：Hannah M，Adelmann GA，Peter J (eds).Ionotropic glutamate receptors in the CNS［M］.Berlin：Springer.1999：472-493.

［4］Gordon GR，Choi HB，Rungta RL，et al.Brain metabolism dictates the polarity of astrocyte control over arterioles［J］.Nature，2008，456(7223)：745-749.

［5］Hediger MA，Welbourne TC.Introduction：glutamate transport，metabolism，and physiological responses［J］.Am J Physiol，1999，277(4)：477-480.

［6］Arriza JL，F(xiàn)airman WA，Wadiche JI，et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex［J］.J Neurosci，1994，14(9)：5559 -5569.

［7］Beart PM，O’Shea RD.Transporters for L-glutamate：an update on their molecular pharmacology and pathological involvement［J］.Br J Pharmacol，2007，150(1)：5-17.

［8］Danbolt NC，Storm-Mathisen J，Kanner BI.An［Na+ +K+］coupled L-glutamate transporter purified from rat brain is located in glial cell processes［J］.Neuroscience，1992，51(2)：295-310.

［9］Levy LM，Warr O，Attwell D.Stoichiometry of the glial glutamate transporter GLT-1expressed inducibly in a Chinese hamster ovary cell line selected for low endogenous Na+dependent glutamate uptake［J］.J Neurosci，1998，18(23)：9620-9628.

［10］Robinson MB.The family of sodium-dependent glutamate transporters：a focus on the GLT-1/EAAT2 subtype［J］.Neurochem Int，1998，33(6)：479-491.

［11］Gegelashvili G，Dehnes Y，Danbolt NC，et al.The high-affinity glutamate transporters GLT1，GLAST，and EAAT4are regulated via different signalling mechanisms［J］.Neurochem Int，2000，37(2-3)：163-170.

［12］Anderson CM，Swanson RA.Astrocyte glutamate transport：review of properties，regulation，and physiological functions［J］.Glia，2000，32(1)：1-14.

［13］Figiel M， Engele J. Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide(PACAP)，a neuron-derived peptide regulating glial glutamate transport and metabolism［J］.J Neurosci，2000，20(10)：3596-3605.

［14］Gonzalez MI，Bannerman PG，Robinson MB.Phorbol myristate acetate-dependent interaction of protein kinase Calpha and the neuronal glutamate transporter EAAC1［J］.J Neurosci，2003，23(13)：5589-5593.

［15］Sullivan R，Rauen T，F(xiàn)ischer F，et al.Cloning，transport properties，and differential localization of two splice variants of GLT-1 in the rat CNS： implications for CNS glutamate homeostasis.Glia 2004，45(2)：155-169.

［16］Bunch L，Erichsen MN，Jensen AA.Excitatory amino acid transporters as potential drug targets［J］.Expert Opin Ther Targets，2009，13(6)：719-731.

［17］Hsieh YC，Athar M，Chaudry IH.When apoptosis meets autophagy：deciding cell fate after trauma and sepsis［J］.Trends Mol Med，2009，15(3)：129-138.

［18］Pandey UB，Nie Z，Batlevi Y，et al.HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS［J］.Nature，2007，447(7146)：859-863.

［19］Taylor JP， Hardy J， Fischbeck KH. Toxic proteins in neurodegenerative disease［J］.Science，2002，296(5575)：1991-1995.

［20］Wang Y，Qin ZH.Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death［J］.Apoptosis，2010，15(11)：1382-1402.

［21］Carafoli E，Santella L，Branca D，et al.Generation，control，and processing of cellular calcium signals［J］.Crit Rev Biochem Mol Biol，2001，36(2)：107-260.

［22］Sheldon AL，Robinson MB.The role of glutamate transporters in neurodegenerative diseases and potential opportunities for intervention［J］.Neurochem Int，2007，51(6-7)：333-355.

［23］S ánchez AM， Rebec GV.Corticostriatal dysfunction and glutamate transporter 1(GLT1) in Huntington's disease：interactions between neurons and astrocytes［J］.Basal Ganglia，2012，2(2)：57-66.

［24］Maragakis NJ，Dietrich J，Wong V，et al.Glutamate transporter expression and function in human glial progenitors［J］.Glia，2004，45(2)：133-143.

［25］Zelenaia O，Schlag BD，Gochenauer GE，et al.Epidermal growth factor receptor agonists increase expression of glutamate transporter GLT-1in astrocytes through pathways dependent on phosphatidylinositol 3-kinase and transcription factor NF-kappaB［J］.Mol Pharmacol，2000，57(4)：667-678.

［26］Su ZZ，Leszczyniecka M，Kang DC，et al.Insights into glutamate transport regulation in human astrocytes：Cloning of the promoter for excitatory amino acid transporter 2(EAAT2)［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(4)：1955-1960.

［27］Schlag BD，Vondrasek JR，Munir M，et al.Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons［J］.Mol Pharmacol，1998，53(3)：355-369.

［28］Sitcheran R，Gupta P，F(xiàn)isher PB，et al.Positive and negative regulation of EAAT2by NF-kappaB：a role for N-myc in TNF alpha-controlled repression［J］.EMBO J，2005，24(3)：510-520.

［29］Li LB，Toan SV，Zelenaia O，et al.Regulation of astrocytic glutamate transporter expression by Akt：evidence for a selective transcriptional effect on the GLT-1/EAAT2subtype［J］.J Neurochem，2006，97(3)：759-771.

［30］Rothstein JD，Patel S，Regan MR，et al.Beta-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression［J］.Nature，2005，433(7021)：73-77.

［31］Romera C， Hurtado O， Mallolas J， et al. Ischemic preconditioning reveals that GLT1/EAAT2glutamate transporter is a novel PPARgamma target gene involved in neuroprotection［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2007，27(7)：1327-1338.

［32］Lee SG，Su ZZ，Emdad L，et al.Mechanism of ceftriaxone induction of excitatory amino acid transporter-2expression and glutamate uptake in primary human astrocytes［J］.J Biol Chem，2008，283(19)：13116-13123.

［33］Wu X，Kihara T，Akaike A，et al.PI3K/Akt/mTOR signaling regulates glutamate transporter 1in astrocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，393(3)：514-518.

［34］Wu J，Moonnoh R，Sun Choi，et al.ENT1regulates ethanolsensitive EAAT2expression and function in astrocytes［J］.Alcohol Clin Exp Res，2010，34(6)：1110-1117.

［35］Wu J，Moonnoh R，Kim T，et al.Regulation of ethanol-sensitive EAAT2expression through adenosine A1receptor in astrocytes［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，406(1)：47-52.

［36］Marica C，Susan D，Marcus R.Riluzole elevates GLT-1activity and levels in striatal astrocytes［J］.Neurochem Int.2012，60(1)：31-38.