張萬(wàn)忠， 杜金峰，， 王 闖， 王云山， 蘇志國(guó)

(1.沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110142;

2.中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所生化工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100190)

乙醇是一種重要的工業(yè)原料，具有安全、清潔、可再生等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域，且可部分或全部替代汽油.目前，利用玉米秸稈發(fā)酵乙醇已在一定程度上減少人類對(duì)化石能源的依賴，但在預(yù)處理和酶解過(guò)程中常伴隨有乙酸、糠醛和羥甲基糠醛等抑制物生成，這些抑制物可以抑制菌體對(duì)糖的消耗，降低其生長(zhǎng)代謝水平［1］.

乙醇發(fā)酵過(guò)程中水解副產(chǎn)物的抑制問(wèn)題一直是阻礙纖維素乙醇發(fā)酵的主要因素之一［2］.近年，對(duì)有機(jī)酸和糠醛類抑制微生物發(fā)酵的研究主要集中在兩個(gè)方面:一是研究有毒物質(zhì)的抑制機(jī)理，并對(duì)菌種改造或改良;二是發(fā)酵液的脫毒處理，通過(guò)物理或化學(xué)的方法，用石灰乳中和［3］、活性炭吸附［4］、真空濃縮［5］和離子交換［6］等多種脫毒方法消除或降低抑制因子的影響，從而有利于發(fā)酵的高效進(jìn)行，獲得高產(chǎn)率的燃料乙醇.

本實(shí)驗(yàn)采用釀酒酵母發(fā)酵生產(chǎn)燃料乙醇，考察玉米秸稈在酶解過(guò)程中水洗、滅菌與碳源加入方式對(duì)乙醇發(fā)酵的影響，初步確定酶解過(guò)程中抑制物的來(lái)源，以期為玉米秸稈乙醇發(fā)酵生產(chǎn)工藝提供借鑒，提高乙醇得率.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

玉米秸稈:產(chǎn)自北京郊區(qū)，自然風(fēng)干的玉米秸稈切成3～4 m長(zhǎng)段，放入超細(xì)粉碎機(jī)中粉碎，粉碎后為100～200目秸稈粉.

纖維素酶:寧夏夏盛實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司出品，濾紙酶活為83 IU/mL，酶活定義為國(guó)際單位(IU)［7］，即1 min產(chǎn)生1 μmol葡萄糖所需酶量為1酶活單位.

高溫釀酒干酵母(Saccharomyces cerevisiae):安琪酵母股份有限公司生產(chǎn).

1.2 儀器與設(shè)備

TS-2102新型恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱，湖北省黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;Anke TGL-16C臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠;XZ-7旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，中科院生物物理所科龍儀器廠;SBA-40 E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所;Ag-ilent 4890氣相色譜儀.

1.3 酶解

稱取處理后的干燥秸稈粉，按照一定的固液比置于250 mL三角瓶中，調(diào)節(jié)底物混合物的pH值為4.8，每克纖維素加入纖維素酶30 IU，在轉(zhuǎn)速為100 r/min、溫度為55℃搖床中振蕩水解48 h，測(cè)定葡萄糖含量.

1.4 乙醇發(fā)酵

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):玉米秸稈水解液1 L(玉米秸稈酶解液于4 000 r·min－1離心15 min，取上清液)，加入(NH4)2SO41 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，pH為5.5.將玉米秸稈水解液配成發(fā)酵培養(yǎng)基，于115℃滅菌20 min，冷卻后接入兩環(huán)活化的安琪耐高溫釀酒酵母，放置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期取樣測(cè)定乙醇含量.

乙醇得率按下式計(jì)算:

m0和m1分別為葡萄糖質(zhì)量(g)和乙醇質(zhì)量(g).

1.5 檢測(cè)方法

葡萄糖的測(cè)定采用SBA-40E生物傳感分析儀.

乙醇的測(cè)定采用氣相色譜法，色譜條件為: FFAP毛細(xì)管色譜柱0.25 mm×30 m，進(jìn)樣口溫度為250℃，柱溫為120℃;FID檢測(cè)器溫度為250℃;進(jìn)樣量為0.6 μL，內(nèi)標(biāo)物為體積分?jǐn)?shù)為2%的正丁醇.

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，乙醇和正丁醇峰面積之比為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1)，曲線的回歸方程為y=0.082 63+3.305x，R=0.999 92.

圖1 乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of ethanol concentration

2.2 水洗對(duì)玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

將稱好的玉米秸稈超細(xì)粉按照固液質(zhì)量比1∶10的比例用自來(lái)水分別清洗3次和5次，考察水洗對(duì)玉米秸稈乙醇發(fā)酵的影響.由圖2可知:隨著水洗次數(shù)的增加，玉米秸稈超細(xì)粉水解液發(fā)酵乙醇得率增加.乙醇發(fā)酵72 h，未水洗、洗3次和洗5次的玉米秸稈乙醇發(fā)酵，乙醇得率分別為36.44%、39.44%和41.18%，說(shuō)明水洗能使玉米秸稈自身帶有的抑制釀酒酵母生長(zhǎng)代謝的抑制物去除，使得乙醇得率提高，水洗5次比未水洗秸稈乙醇得率提高了13%.

圖2 水洗對(duì)秸稈乙醇發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of washing on ethanol fermentation

2.3 滅菌對(duì)玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

將玉米秸稈超細(xì)粉在酶解前分別進(jìn)行滅菌與不滅菌，考察秸稈微生物對(duì)乙醇發(fā)酵的影響.由圖3可知:玉米秸稈超細(xì)粉不滅菌比滅菌發(fā)酵乙醇得率高.在滅菌的情況下，雖然乙醇得率直線上升，但是速率較慢，乙醇得率達(dá)到最高值耗時(shí)較長(zhǎng)，發(fā)酵72 h乙醇得率為36.44%;在未滅菌的情況下，前48 h反應(yīng)速率較快，60 h時(shí)達(dá)到最高值，為39.63%，比滅菌的乙醇得率提高了8.75%.由此可見(jiàn)，秸稈酶解前滅菌會(huì)使玉米秸稈產(chǎn)生不利于釀酒酵母生長(zhǎng)的物質(zhì)，影響乙醇發(fā)酵得率，因此，玉米秸稈可不需滅菌直接酶解，即提高乙醇得率又節(jié)省時(shí)間.

圖3 滅菌對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of sterilization on ethanol fermentation

2.4 碳源加入方式對(duì)玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的影響

玉米秸稈超細(xì)粉有兩種情況提高水解液中葡萄糖含量:一是將秸稈酶解后的水解液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮，二是采用分批加料的方式酶解.考察兩種情況對(duì)乙醇發(fā)酵的影響.由圖4可知:釀酒酵母在濃縮后的水解液中消耗葡萄糖較慢，在分批加料水解液中消耗葡萄糖較快，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)乙醇得率分別為36.44%和47.01%，分批加料水解液比濃縮液乙醇得率提高了29%，說(shuō)明對(duì)水解液進(jìn)行濃縮雖然能夠提高葡萄糖含量，但在濃縮的同時(shí)非揮發(fā)性的抑制物濃度也同步增加，不利于釀酒酵母生長(zhǎng)代謝，使得乙醇得率降低，可知玉米秸稈在酶解時(shí)可采用分批加料的方式.

圖4 水解液濃縮與分批加料對(duì)乙醇發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of two methods on ethanol fermentation

3 結(jié)論

玉米秸稈的水洗次數(shù)、滅菌與碳源加入方式對(duì)其發(fā)酵生產(chǎn)乙醇有一定影響，玉米秸稈超細(xì)粉在水洗5次、酶解前不滅菌、通過(guò)分批加料的方式得到的水解液發(fā)酵乙醇得率分別為41.18%、39.63%和47.01%，與未水洗、滅菌和旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮的水解液相比，乙醇得率分別提高了13%、8.75%和29%.

［1］ 班靖洋，張栩，譚天偉.以甜高粱渣為原料發(fā)酵生產(chǎn)乙醇［J］.北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，34(6):637－639.

［2］ 何北海，林鹿，孫潤(rùn)倉(cāng)，等.木質(zhì)纖維素化學(xué)水解產(chǎn)生可發(fā)酵糖研究［J］.化學(xué)進(jìn)展，2007，19(7/8): 1141－1146.

［3］ 莊軍平，林鹿，龐春生，等.木質(zhì)纖維素稀水解液脫毒研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代工業(yè)，2009，29(2):19－23.

［4］ 黃秀梅，李建，陳可泉，等.利用玉米秸稈水解液厭氧發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究［J］.中國(guó)釀造，2009(6): 31－34.

［5］ 劉小杰，郭秀峰，歐凱.利用纖維素酶降解稻草粉的研究［J］.中國(guó)食品添加劑，2009(4):99－102.

［6］ 張揚(yáng)，王運(yùn)紅，鄧立紅，等.稻秸半纖維素水解條件和水解液脫毒的研究［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2005，13(2):42－43.

［7］ Ghoset T K.Measurement of Cellulase Activities［J］.Pure and Appl.Chem，1987，59(2):257－268.