劉雅祺， 申延明， 樊麗輝， 劉東斌， 陳曉宇

(沈陽化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，遼寧沈陽110142)

辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，簡稱HRP)是商品化較早、應(yīng)用最廣泛的一種酶制劑，從常年生香草辣根中提取，來源廣泛，價格相對低廉［1－3］.能在較寬的溫度、pH值、污染物濃度和鹽度范圍內(nèi)保持其催化活性.另外，不像其他具有同樣功能的酶，HRP對有機(jī)底物的專一性要求不高，胺類、酚類等芳香化合物均可成為其底物，因此特別適合于含多種芳香性物質(zhì)的工業(yè)廢水處理，在含酚廢水，染料廢水等工業(yè)廢水處理有著潛在的應(yīng)用前景［4－5］.由于HRP溶液酶不能重復(fù)使用，且其活性會受其他污染物影響而降低，酶使用1次后即成為新的污染物，因此阻礙了酶在廢水處理中的推廣應(yīng)用［6］.酶經(jīng)固定化后穩(wěn)定性大大提高，可重復(fù)或連續(xù)使用，這樣不僅降低了廢水處理的成本，而且還避免了蛋白質(zhì)的污染等問題［1］.隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，固定化的載體材料已從最初的天然高分子材料發(fā)展到合成高分子材料、無機(jī)材料以及復(fù)合材料等［7］.多孔的高分子化合物具有表面積大，化學(xué)穩(wěn)定性高，具有更好的疏水性和生物兼容性，可作為辣根過氧化物酶的固定材料.本文采用Breath Figures法制得蜂窩狀結(jié)構(gòu)的聚苯乙烯微孔膜，將HRP固定在聚苯乙烯微孔膜上，以自制的苯酚水溶液為模擬溶液，測試固定化HRP酶催化氧化苯酚性能.

1 實驗部分

1.1 主要試劑和儀器

聚苯乙烯(PS，相對分子質(zhì)量235 000)，遼寧盤錦乙烯有限責(zé)任公司;單羧基封端聚苯乙烯(PS-COOH，相對分子質(zhì)量 50 000)，Scientific polymer products Inc;辣根過氧化物酶，上海源葉生物科技有限公司;其他試劑均為分析純.

T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;XSP-8C生物顯微鏡，上海長方光學(xué)儀器有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂窩狀結(jié)構(gòu)微孔膜的制備

將線性聚苯乙烯(PS)和單羧基聚苯乙烯(PS-COOH)按質(zhì)量比1∶2混合，溶于氯仿中，密封，超聲波震蕩溶解，待完全溶解后，靜置消泡，配置溶液質(zhì)量濃度為50 g/L.將載玻片在超聲波清洗器中依次用重鉻酸鉀洗液、乙醇及蒸餾水充分清洗，烘干備用.室溫下，在相對濕度65%條件下，用移液器移取約80 μL聚合物溶液澆鑄在載玻片上，立即用經(jīng)水飽和的濕空氣吹拂溶液表面，空氣流量600 mL/min，待溶劑和水揮發(fā)完畢后，制得PS微孔膜.用蒸餾水沖洗，使微孔膜從載玻片上脫落，室溫下烘干待用.

1.2.2 HRP的固定

稱取0.1 g可溶性碳二亞胺溶于10 mL、0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.0)中，在室溫下將制得的微孔膜浸泡0.5 h，取出后用蒸餾水沖洗2～3次，濾紙浸干.

精確稱取酶粉，用0.2 mol/L的PBS(pH= 7.0)配成一定濃度酶液.將0.3 g經(jīng)活化處理后的微孔膜浸潤在4 mL不同濃度的酶溶液中，低溫下放置一定時間后，用蒸餾水沖洗，低溫保存.合并殘液和沖洗液，測定溶液酶活.

游離和固定化酶活的測定參照文獻(xiàn)［8］.

酶活回收率=［固定化酶總活力/

(原酶液酶活量－

濾液酶酶活量)］×100%.

1.2.3 固定化HRP催化苯酚氧化

采用4-氨基安替比林分光光度法［9］測定水中的苯酚濃度，此法適用于低濃度苯酚溶液，對于高濃度的苯酚溶液，可采用稀釋后測定的方法.

移取1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的雙氧水于100 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100 mL.在100 mL的小燒杯中加入40 mL已知濃度的苯酚溶液，加入一定質(zhì)量的固定化HRP，緩慢滴入一定體積經(jīng)稀釋過的雙氧水，低速磁力攪拌，反應(yīng)一段時間后取出固定化酶，并向反應(yīng)液中加入少量MnO2，將反應(yīng)剩余的雙氧水分解.用帶有濾膜(0.45 μm)的20 mL注射器過濾取樣，分析濾液中苯酚的濃度.將使用過的固定化酶用蒸餾水沖洗幾次后低溫保存、待用.

苯酚去除率=［(原溶液中苯酚質(zhì)量－

處理后溶液中苯酚質(zhì)量)/

原溶液中苯酚質(zhì)量］×100%.

2 結(jié)果與討論

2.1 HRP的固定化

2.1.1 微孔膜固載HRP前后光學(xué)圖片

圖1為固載HRP 3 h前后微孔膜在光學(xué)顯微鏡下的照片.

圖1 固定化前后蜂窩狀微孔膜光學(xué)顯微鏡下照片(400倍)Fig.1 The optical photos of PS microporous membrane(400 times)immobilization

從圖1(a)可以看出，PS微孔膜具有規(guī)則的蜂窩狀結(jié)構(gòu).Zhang等［10］認(rèn)為，利用Breath Figures法制備蜂窩狀微孔膜時，在微孔形成過程中，聚苯乙烯上的疏水基團(tuán)定向地朝向溶液的疏水側(cè)排列，而親水基團(tuán)朝向水滴的一側(cè)排列，水滴揮發(fā)完之后，親水基團(tuán)在微孔表面規(guī)整排列.在利用Breath Figures法制備蜂窩狀微孔膜時，羧基封端聚苯乙烯上的羧基定向地朝水滴一側(cè)排列，這些羧基經(jīng)碳二亞胺活化后，可與酶分子上的氨基共價結(jié)合［11］，羧基的活化及酶的固定化反應(yīng)如圖2所示.觀察圖1(b)發(fā)現(xiàn)，固載后膜表面仍然呈現(xiàn)蜂窩狀結(jié)構(gòu)，但孔壁較固載前明顯變厚，孔徑減小，說明微孔表面經(jīng)碳二亞胺活化的羧基與HRP連接，HRP固載在微孔表面.

圖2 微孔膜的活化和酶的固定化反應(yīng)Fig.2 The reactions for activation of membrane and enzyme immobilization

2.1.2 HRP酶溶液質(zhì)量濃度

載體與酶量的配比對酶的固定化影響較大，酶溶液質(zhì)量濃度對固定化酶的活性和酶活回收率的影響如圖3所示.

圖3 酶溶液質(zhì)量濃度對酶固定化的影響Fig.3 The influence of HRP concentration on HRP activity

從圖3可知:隨著酶溶液質(zhì)量濃度的增加，酶活回收率迅速降低;當(dāng)酶液質(zhì)量濃度小于1.0 g/L時，隨酶溶液質(zhì)量濃度的增大，固定化酶的活性迅速升高;繼續(xù)增大酶液質(zhì)量濃度，固定化趨于穩(wěn)定，酶活有下降趨勢.其原因可能是:其一，繼續(xù)增加酶液質(zhì)量濃度后，微孔膜能與酶結(jié)合的位點(diǎn)達(dá)到飽和，此時酶分子相互聚集成團(tuán)，雖然膜上結(jié)合了較多的酶分子，但內(nèi)層的酶因擴(kuò)散阻力過大而難以與底物結(jié)合，表現(xiàn)不出來酶活;其二，微孔膜上能與酶結(jié)合的位點(diǎn)是固定的，酶量過多，酶分子相互擁擠，空間位阻增大，底物與產(chǎn)物不能及時擴(kuò)散，酶活的回收率迅速降低.為得到活性較高的固定化酶，同時，考慮酶活性的回收率，適宜的酶溶液質(zhì)量濃度為1 g/L.

2.1.3 固定化時間

分別將活化膜在1 g/L的酶液中固定0.5、1、2、3、4及5 h，其他條件不變，考察不同固定化時間對酶固定化的影響，結(jié)果如圖4所示.固定3 h內(nèi)，隨固定化時間的延長，固定化酶的酶活和回收率迅速上升，進(jìn)一步延長固定時間，固定化酶酶活和酶活回收率均急速下降.這可能由于固定化時間過長，微孔膜能與酶結(jié)合的位點(diǎn)達(dá)到飽和，無法結(jié)合更多的過氧化物酶，同時過多的酶使空間位阻也增大;另外，游離酶在緩沖溶液中過久易導(dǎo)致變性失活，從而使酶活和回收率下降.故適宜的固定化時間為3 h.

圖4 固定化時間對酶固定化的影響Fig.4 The influence of immobilizing time on HRP activity

2.2 HRP固定化酶催化氧化苯酚性能

2.2.1 固定化酶用量

以苯酚去除率為目標(biāo)考察HRP固定化酶催化性能.固定化酶的使用量是苯酚去除率至關(guān)重要的影響因素之一.分別取不同質(zhì)量的固定化HRP催化氧化質(zhì)量濃度為500 mg/L的苯酚溶液，其中固定化酶在固定化各因素最佳條件下制得，實驗取苯酚與H2O2的摩爾比為1∶1，反應(yīng)時間2 h.實驗結(jié)果如圖5所示.

圖5 固定化酶用量對苯酚去除率的影響Fig.5 The influence of immobilized HRP dosage on phenol removal

圖5中，當(dāng)固定化酶用量為5 g/g時，苯酚去除率是46%，增加固定化酶用量到10 g/g時，苯酚去除率明顯增加達(dá)到65%左右，繼續(xù)增加固定化酶用量后，去除率達(dá)70%以上，此時去除率的變化趨于平緩.這是因為當(dāng)酶量較高時，反應(yīng)產(chǎn)物會與原酶結(jié)合占據(jù)酶的活性中心，產(chǎn)生反饋抑制現(xiàn)象，從而使部分酶失活［12］.綜上，1 g苯酚適宜的固定化酶用量為15 g.

2.2.2 酶催化氧化時間

取0.3 g固定化HRP，其他條件與2.2.1相同，考察反應(yīng)時間對苯酚去除率的影響，從開始加入H2O2時開始記時，結(jié)果如圖6所示.當(dāng)加入H2O2時，反應(yīng)體系顏色立即變?yōu)辄S色，隨反應(yīng)時間的延長，溶液顏色由黃棕色向棕色、黑色變化，此時苯酚逐漸形成聚合物以固態(tài)出現(xiàn)在溶液中.不加H2O2或固定HRP都觀察不到溶液顏色的變化.從圖6可看出，在反應(yīng)開始的50 min內(nèi)，固定化酶催化苯酚的速度非?？欤椒尤コ拭黠@增加，大于50 min后，由于反應(yīng)體系中苯酚、雙氧水的減少和酶的失活，反應(yīng)趨于緩慢，表明此時反應(yīng)已達(dá)到平衡，延長反應(yīng)時間對反應(yīng)平衡影響不大，故取50 min為最佳反應(yīng)時間.

圖6 反應(yīng)時間對苯酚去除率的影響Fig.6 The influence of reaction time on phenol removal

2.2.3 H2O2的用量

H2O2用量對苯酚去除率存在影響.取苯酚溶液初始質(zhì)量濃度500 mg/L，其他條件取最佳反應(yīng)條件，結(jié)果見圖7.由于殘留雙氧水的存在會影響苯酚質(zhì)量濃度的分析，反應(yīng)后所有樣品都加入少量MnO2，以使過量的雙氧水分解.由圖7可知，當(dāng)苯酚去除率達(dá)76%左右時，H2O2與苯酚的摩爾比為3∶2，此時H2O2用量為1.237 5 mL.當(dāng)H2O2與苯酚的摩爾比小于3∶2時，苯酚去除率隨著H2O2量的增加明顯提高;H2O2與苯酚的摩爾比大于3∶2時，隨雙氧水量的增加，苯酚去除率呈下降趨勢.這是由于固定化酶催化酚類物質(zhì)的聚合是依靠活性中心鐵離子價態(tài)的變化來傳遞電子，當(dāng)H2O2的用量超過一定值時，因雙氧水的氧化作用使部分鐵離子被氧化成高價態(tài)，從而失去催化功能［13］.綜上，實驗得到的H2O2與苯酚的最佳摩爾比為3∶2.

圖7 雙氧水用量對苯酚去除率的影響Fig.7 The influence of hydrogen peroxide dosage on phenol removal

2.2.4 苯酚溶液質(zhì)量濃度

工業(yè)中含酚水的質(zhì)量濃度一般從微量到幾百毫克每升都有，質(zhì)量濃度分布較寬，為考察不同初始質(zhì)量濃度的苯酚溶液對固定化酶催化性能的影響，取一定量的固定化酶用于不同初始質(zhì)量濃度苯酚溶液的催化氧化實驗，其他條件為以上各因素最佳條件，為達(dá)到盡量好的去除效果，反應(yīng)時間取2 h，結(jié)果如圖8所示.

圖8 苯酚溶液初始質(zhì)量濃度對苯酚去除率的影響Fig.8 The influence of initial phenol concentration on phenol removal

2.2.5 HRP固定化酶的循環(huán)使用性

與溶液酶相比，固定化酶可以循環(huán)使用.以0.3 g的HRP固定化酶，處理40 mL，質(zhì)量濃度為500 mg/L的苯酚溶液，每次反應(yīng)后把固定化酶用蒸餾水沖洗，立即用于下次重復(fù)實驗，其他條件均為上述討論最佳條件，結(jié)果如圖9所示.從圖9可以看出，隨著固定化HRP循環(huán)使用次數(shù)的增加，其對苯酚的去除率迅速下降，2次使用后苯酚的去除率與第1次相比降低了60%左右，循環(huán)使用3次后，固定化HRP對苯酚的去除率降為4.26%，說明固定化酶在催化過程中存在失活現(xiàn)象.

圖9 固定化HRP酶循環(huán)使用結(jié)果Fig.9 The result of recycle for immobilized HRP enzyme

HRP失活是多種因素的影響，文獻(xiàn)報道稱主要有3個因素:一是HRP在催化循環(huán)中生成沒有活性的惰性中間產(chǎn)物［14］，二是催化反應(yīng)中生成的酚氧自由基進(jìn)攻酶的活性中心，從而導(dǎo)致HRP失活［15］，三是在催化反應(yīng)中生成的聚合產(chǎn)物沉積在固定化酶上，包裹了酶的活性中心［16］.徐莉等［17］在對酶的固定化方法介紹中認(rèn)為，共價結(jié)合法，其酶與載體間連接牢固，即使用高濃度底物或離子強(qiáng)度的溶液進(jìn)行反應(yīng)，也不會導(dǎo)致酶和載體的分離，因此循環(huán)使用中HRP的失活是HRP自身活性降低所導(dǎo)致的失活，而不是HRP與微孔膜分離后流失所致.此外，程俊、于少明等［18］認(rèn)為在反應(yīng)液中加入助劑，如聚乙二醇等，能有效地防止酚氧自由基對酶活性中心的攻擊和聚合產(chǎn)物對酶的包裹，它們對產(chǎn)物的親和性大于酶對產(chǎn)物的親和性，產(chǎn)物優(yōu)先與助劑結(jié)合，大大減緩HRP的失活速率，延緩酶的使用周期.本文在考察HRP固定化酶的循環(huán)使用性時未添加任何的保護(hù)助劑，使固定化酶在循環(huán)使用中失活較嚴(yán)重.綜上，HRP的失活應(yīng)該主要是上述二和三的綜合作用.

3 結(jié)論

以聚苯乙烯蜂窩狀微孔膜為載體，碳二亞胺為活化劑制備固定化HRP，HRP固定化適宜酶溶液質(zhì)量濃度為1 g/L，固定化時間3 h.HRP固定化酶催化氧化苯酚表明，HRP固定化酶在較寬的底物濃度范圍內(nèi)對苯酚有較好的催化效果，苯酚質(zhì)量濃度在200～600 mg/L范圍內(nèi)都有較高的去除率，適宜固定化酶用量為15 g/g，最佳反應(yīng)時間為50 min，H2O2與苯酚的最佳摩爾比為3∶2，在此條件下苯酚的去除率在76%左右.HRP固定化酶可循環(huán)使用3次，3次后其對苯酚的去除率降為4.26%.聚苯乙烯微孔膜固定化HRP的使用效果還有待于進(jìn)一步提高.

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