蔡 亮，張 紅，高立冬，劉運芝，胡世雄，劉富強，曾 舸，劉佳惠，李俊華

漢坦病毒M、S基因分型及種系進化分析＊

蔡 亮，張 紅，高立冬，劉運芝，胡世雄，劉富強，曾 舸，劉佳惠，李俊華

目的探討湖南省腎綜合征出血熱（HFRS）患者及宿主動物黑線姬鼠攜帶漢坦病毒的基因型別及序列特征。方法應(yīng)用免疫熒光試驗（IFA）對鼠肺標本進行粗篩，提取IFA陽性鼠肺組織及HFRS患者血清總RNA，設(shè)計漢坦病毒M、S基因特異性引物，應(yīng)用RT－PCR技術(shù)進行擴增，回收陽性擴增產(chǎn)物并克隆到p MD－18 T載體進行序列測定，將所測序列與國內(nèi)外HTNV及SEOV病毒株序列進行核苷酸同源性分析，應(yīng)用MEGA5．0．4軟件構(gòu)建M、S基因種系進化樹。結(jié)果IFA陽性鼠肺標本熒光顯微鏡下可見散在的黃綠色針尖大小樣顆粒；RT－PCR法擴增漢坦病毒M、S基因，HTNV通用引物可見490 bp與593 bp的陽性條帶；陽性產(chǎn)物進一步應(yīng)用HTNV分型引物進行M、S基因檢測，分別擴增出一約242 bp與276 bp大小的條帶；SEO型特異性M、S基因片段內(nèi)側(cè)引物擴增反應(yīng)均為陰性；編號為Hunan01、Hunan02、Hunan03的M、S基因序列與HTNV型84FLi株、SN7株的同源性最高，與SEOV型Gou3株的同源性最低；種系進化分析表明，Hunan01、Hunan02、Hunan03為漢坦病毒H5亞型。結(jié)論湖南省存在HTNV型感染病例與宿主動物，基因分型技術(shù)能進一步對病毒亞型進行鑒定。

腎綜合征出血熱；漢坦病毒；M基因；S基因；分型；種系進化

漢坦病毒（Hantavirus，HV）屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）漢坦病毒屬，編碼L、M、S 3個基因片段［1］，目前至少可以分為30個血清型／基因型，一些新的HV屬病毒還在不斷的發(fā)現(xiàn)中，主要引起腎綜合征出血熱（HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（HPS），基因組內(nèi)極易發(fā)生變異，全球約90%以上的 HFRS 病 例 發(fā) 生 在 中 國［2－4］。 為 了 解 湖 南 省HFRS患者及宿主動物攜帶漢坦病毒基因的型別及變異情況，我們應(yīng)用IFA、RT－PCR、基因測序與種系分子進化等方法對HFRS患者血清及宿主動物鼠肺組織標本進行了檢測與分析，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1．1 菌株、標本 E．coli DH 5a為湖南省疾病預(yù)防控制中心微生物實驗室保種；鼠肺組織標本來源于國家級HFRS監(jiān)測點湖南省寧鄉(xiāng)縣；病例標本來自全省HFRS患者血清。

1．2 主要試劑與儀器 Trizol＠ Regeant（Invitrogen，美 國）、p MD－18 T 載 體、T 4 DNA 連 接 酶、QIAamp viral RNA Mini kit（QIAGENE，德國）、PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（Ta Ka－Ra）、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver．2．0（Ta KaRa），LA PCRTMKit Ver．2．1 （Ta KaRa），2 000 bp DNA Marker、SOC培養(yǎng)基、IPTG、X－Gal等均為Ta KaRa公司產(chǎn)品，PCR儀（PCT－200 Thermal，德國），BigDye Terminator 3．1／1．1 version sequencing kit（ABI，美國），Applied Biosystems 3730 sequencer（ABI，美國），超低溫組織冷凍切片機（Leica，德國）。

1．3 引物設(shè)計與合成 參照已知漢坦病毒國際標準株76－118株 M、S基因片段核苷酸序列（Gen－Bank Accession No：M14627．1，M14626．1）及相關(guān)文獻設(shè)計特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物、擴增引物與分型引物，委托寶生物（大連）合成，見表1。

1．4 IFA鼠肺組織標本應(yīng)用IFA進行粗篩，鼠經(jīng)斷頸處死，3%來蘇水浸泡5 min，無菌條件下解剖取肺臟，低溫冷凍切片（4～10μm），切片應(yīng)用FITC標記的HV直接熒光血清（中國疾病預(yù)防控制中心病毒病所出血熱室提供）于37℃水浴箱孵育30 min，熒光顯微鏡下進行觀察。具體操作參考全國腎綜合征出血熱診斷標準進行，陽性標本及疑似陽性標本采用巢式PCR進行復(fù)核與基因分型。

1．5 總RNA提取 取100mg IFA陽性肺組織于冰上碾磨，參照Trizol＠Reagent試劑說明書提取鼠肺組織總RNA，溶于40μL DEPC水。

1．6 RT－PCR 應(yīng)用 P1引物及 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒合成c DNA，反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進行；巢式PCR分兩輪進行：首輪應(yīng)用漢坦病毒M基因通用上下游引物（20μmol／L）與LA PCRTMKit Ver．2．1試劑盒進行擴增，陽性產(chǎn)物應(yīng)用M基因特異性分型上下游引物（20μmol／L）進行第二輪擴增。對M基因陽性標本，在相同條件下進行S基因的擴增與分型，具體反應(yīng)體系與反應(yīng)條件參考試劑盒說明書進行。

1．7 T－A克隆與測序 PCR產(chǎn)物經(jīng)1．5%瓊脂糖凝膠電泳，按照Agarose Gel DNA Purification Kit試劑盒說明書進行切膠純化回收，回收產(chǎn)物與p MD－18 T載體進行連接，轉(zhuǎn)化到E．coli DH5a感受態(tài)細胞，建立T－A克?。?］。采用藍白斑篩選和PCR法對陽性克隆進行鑒定，克隆產(chǎn)物通過質(zhì)粒提取純化后在ABI3730基因測序儀上參照BigDye Terminator 3．1／1．1 version sequencing kit試劑盒說明書進行序列測定。

1．8 序列分析 運用 ATGC（Gentyx Co．，Tokyo，Japan）生物學(xué)軟件對所測序列進行校對與拼接，對拼接后的序列進行命名，運行BLAST與DNAStar（Lasergene○Rv8．0）程序與 GenBank報道的漢坦病毒HTNV及SEOV型病毒株M基因、S基因序列進行核苷酸比較，應(yīng)用BioEdit等生物學(xué)軟件對所獲序列進行基因組成特征的分析。

1．9 進化分析 選擇GenBank公布的不同地區(qū)有代表意義的漢坦病毒M、S基因序列用于后續(xù)的分子進化分析，應(yīng)用CLUSTAL W 軟件（Version 1．83 package．Thompson et al．，1997）進行多重序列比對，Mega5．0．4（Kumar et al．，）生物學(xué)軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié) 果

2．1 IFA 150份鼠肺組織中，檢出3份IFA陽性標本，陽性標本于熒光顯微鏡下可見散在的針尖大小的黃綠色顆粒，呈均勻分布于感染細胞的胞漿內(nèi)，正常對照組織被染成橙紅色，未見特異性的熒光顆粒。見圖1。

2．2 RT－PCR 60份 HFRS患者血清經(jīng) RTPCR檢測漢坦病毒M、S基因，2份標本 M、S基因通用引物可見明顯的陽性擴增條帶（Hunan H01、Hunan H02），條帶大小約490 bp與593 bp，與預(yù)期大小一致。3份IFA陽性鼠肺標本經(jīng)RT－PCR檢測漢坦病毒M、S基因，1份為陽性（Hunan H03），產(chǎn)物大小為490 bp與593 bp。3份PCR通用引物陽性標本應(yīng)用HTNV特異性分型引物進行檢測，均擴增出一242 bp與276 bp大小的條帶，SEOV型特異性分型引物擴增結(jié)果均為陰性，與預(yù)期結(jié)果一致。見圖2。

2．3 測序及同源性分析 對3份M、S基因通用引物PCR 陽性標本（Hunan H01、Hunan H02、Hunan H03）擴增產(chǎn)物進行T－A克隆后應(yīng)用ABI3730基因分析儀進行序列測定，經(jīng)序列拼接與校正，大小與預(yù)期結(jié)果一致。編號為Hunan H01、Hunan H02、Hunan H03株測序結(jié)果去掉引物序列信息及引物附近的核苷酸序列信息后與漢坦病毒國際標準株76－118株核苷酸序列 M基因（1 190 nt～1 680 nt）的比較堿基同源性分別為85%、84%和86%，S基因（494 nt～1 086 nt）的比較堿基同源性分別為85%、84%和83%；與其他HTNV型及SEOV型病毒M基因片段（1190 nt～1 680 nt）堿基同源性的比較見表2，S基因片段（494 nt～1 086 nt）堿基同源性比較見表3。

2．4 種系進化分析 M基因部分核苷酸（1 190 nt～1 680 nt）種系進化分析結(jié)果見圖3，由圖可知，2株人源性漢坦病毒（Hunan H01、Hunan H02）株與1株鼠源性漢坦病毒株（Hunan H03）處于同一組內(nèi)，核苷酸序列顯示為高度同源，與分離自HFRS病人的84Fli株（H5）在同一分支上，進化上顯示出高度的同源性，與SN7株在同一組上，具有較高的同源性和較近的進化關(guān)系。

S基因部分核苷酸（494nt～1086nt）種系進化分析結(jié)果見圖4，3株漢坦病毒（Hunan H01、Hunan H02、Hunan H03）與SN7株完全聚集在一個組內(nèi)，與84Fli（H5）、KY、SN7、Chen4等株在同一分支內(nèi)，親緣關(guān)系較近。

表1 漢坦病毒逆轉(zhuǎn)錄與分型引物Tab．1 Primer sets designed for hantavirus reverse transcription and genotyping

圖1 IFA法檢測鼠肺組織中漢坦病毒抗原A：IFA陽性結(jié)果；B：IFA陰性對照Fig．1 Immunofluorescence assay（IFA）of hantavirus in lung tissues of rats A：IFA positive result；B．IFA negative result

3 討 論

早期HV的實驗室診斷與分型多采用免疫熒光染色試驗（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、反向被動血凝抑制試驗（RPHI）和空斑減少中和試驗（PRNT）等經(jīng)典方法進行［6］，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，上述方法均顯示出了一定的局限性。目前，基因分型技術(shù)在HV感染后的回顧性流行病學(xué)調(diào)查及流行毒株型別的鑒定中得到了廣泛的應(yīng)用［7］。

本文在應(yīng)用FITC標記的抗HV病毒單克隆抗體對宿主動物鼠肺組織標本進行IFA粗篩的同時，還利用RT－PCR技術(shù)對IFA陽性鼠肺標本及HFRS患者血清標本進行了M基因、S基因相關(guān)片段的檢測與序列測定，為進一步達到基因分型的目的，根據(jù)宋干等報道的我國存在Hantaan（HTNV）和Seoul（SEOV）型病毒的研究結(jié)果［8－9］，在引物設(shè)計方面，參考了國際上公布的HTNV與SEOV相關(guān)序列進行綜合分析所得。檢測結(jié)果表明，在150份宿主動物鼠肺組織中通過IFA試驗檢測到了3份HV病毒特異性抗原的存在，在IFA陽性標本與HFRS患者血清中應(yīng)用RT－PCR法共檢測到3份漢坦病毒 M基因、S基因同時陽性的標本，其中Hunan H01、Hunan H02源自HFRS患者血清，Hunan H03源自宿主動物黑線姬鼠肺組織。進一步應(yīng)用所設(shè)計的分型引物進行擴增，同時擴增出M基因（1190nt～1680nt）、S基因（494nt～1086nt）相應(yīng)大小的基因片段，表明所建立的PCR方法在漢坦病毒基因檢測與分型中具有較好的特異性，可以推廣應(yīng)用。

圖2 RT－PCR檢測漢坦病毒 M、S基因及其分型（1．5%瓊脂糖凝膠電泳）M：100bp DNA Marker；1－3：Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒 M基因通用引物；4－6：Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒M基因特異性分型引物；7－9：Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒S基因通用引物；10－12：Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒S基因特異性分型引物；13：PCR陰性對照Fig．2 RT－PCR and genotyping results of hantavirus M and S genes（1．5%agrose gel）M：100bp DNA Marker；1－3：PCR results of Hunan01，Hunan02 and Hunan03 with hantavirus M genes general primers；4－6：PCR results of Hunan01，Hunan02 and Hunan03 with hantavirus M genes special genotyping primers；7－9：PCR results of Hunan01，Hunan02 and Hunan03 with hantavirus S gene general primers；10－12：PCR results of Hunan01，Hunan02 and Hunan03 with hantavirus S gene special genotyping primers；13：PCR negative control．

表2 編號Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒M基因部分核苷酸與其他漢坦病毒株同源性比較Tab．2 Homology comparison on partial nucleotide sequence of hantavirus M gene from Hunan01，Hunan02 and Hunan03 to the other strains（%）

對M基因、S基因序列的測定，采用了正反引物同時進行，通過生物信息學(xué)方法對序列進行相互比對和核實，確保了測序結(jié)果的準確性。對所獲3份標本M、S基因核苷酸序列與已公布的漢坦病毒屬HTNV型和SEOV型M、S基因進行對比，3份標本M、S基因核苷酸均與84FLi株同源性最高，在85%～99%之間，與SEOV屬Gou3株同源性最低，僅為76%～80%。

表3 編號Hunan01，Hunan02，Hunan03漢坦病毒S基因部分核苷酸與其他漢坦病毒株同源性比較Tab．3 Homology comparison on partial nucleotide sequence of hantavirus S gene from Hunan01，Hunan02 and Hunan03 to the other strains（%）

我國流行的HV種系進化研究表明，HTNV可分為9個亞型，而SEOV分為4－6個亞型，表現(xiàn)為相對穩(wěn)定［10］，另有研究表明，漢坦病毒部分核苷酸序列分析可以代表完整的基因序列進行分子進化的分析［11］，本研究中，我們對M基因、S基因部分核苷酸進行了種系分子進化分析，Hunan H01、Hunan H02及Hunan H03均與HTNV聚集在一個大分支下，進一步的M、S基因亞型分析結(jié)果顯示Hunan H01、Hunan H02及Hunan H03與為H5亞型84Fli株在同一組內(nèi)，提示3份標本均為HTNV型H5亞型，與PCR分型檢測結(jié)果一致。

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Detection and genotyping of hantavirus M and S gene and its phylogenetic analysis

CAI Liang，ZHANG Hong，GAO Li－dong，LIU Yun－zhi，HU Shi－xiong，LIU Fu－qiang，ZENG Ge，LIU Jia－h(huán)ui，LI Jun－h(huán)ua

（Hunan Provincial Center for Disease Control and Prevention，Key Laboratory of Microbial Molecular Biology of Hunan Province，Changsha 410005，China）

To investigate the genotype and characteristic of hantavirus M and S hemorrhagic fever with renal syndrome（HFRS），lung tissues of rats were screened by immun of luorescent antibody assay （IFA），and the total RNA was extracted from the serum of HFRS patients and IFA positive lung tissues．RT－PCR was applied to amplify the M and S gene of hantavirus after specific primers were designed．PCR positive product was recovered and purified before cloning to the p MD－18 T vector and the sequencing was carried by ABI3730 gene sequencer．The obtained sequencings were compared to the HTNV and SEOV sequences of han tavirus for nucleotide homology analysis and applied MEGA5．0．4 software to construct the phylo genetic tree．The yellow－green needle－like particles were scattered in the positive lung tissues under fluorescence microscope．The PCR products of M and S gene was about 490bp and 593bp with general primers and the further amplification with HTNV typing primers to the M and S gene was respectively 242bp and 276bp，while the amplified results of M and S gene were negative with the primers of SEOV．The sequences of Hunan01，Hunan02 and Hunan03 had a high nucleotide homology to the 84FLi and SN7 strains，which had a lower homology to the Gou3 strain．Hunan01，Hunan02 and Hunan03 were belonged to H5 subtype of HTNV．In conclusion，the technology of genotyping is appropriate for hantavirus diagnosis，and the HTNV patients and animal hosts are exist in Hunan Province．

HFRS；hantavirus；M gene；S gene；genotyping；phylogenetic

湖南省疾病預(yù)防控制中心，湖南省微生物分子生物學(xué)重點實驗室，長沙 410005

R373

A

1002－2694（2012）02－0111－05

＊湖南省衛(wèi)生廳科研基金（No．A2007008）和湖南省科技廳科研基金（No．2010TD2027）聯(lián)合資助

李俊華，Email：hncdc＿ljh＠163．com

2011－08－11；

2011－09－26