陳超群，吳移謀，任 林，劉良專

肺炎嗜衣原體Cpn0797蛋白的生物信息學(xué)分析及其單克隆抗體制備鑒定＊

陳超群1，吳移謀1，任 林2，劉良專1

目的生物信息學(xué)分析肺炎嗜衣原體Cpn0797蛋白的結(jié)構(gòu)，制備特異性的抗Cpn0797蛋白的單克隆抗體。方法用ProtParam、SignalP、NPS＠ 、和PSORT等軟件對Cpn0797蛋白的理化參數(shù)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、蛋白亞細胞定位進行分析；原核表達純化GST－Cpn0797融合蛋白，以其為免疫原免疫BALB／c小鼠，雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體，采用間接免疫熒光法鑒定單克隆抗體的亞類和特異性。結(jié)果生物信息學(xué)分析表明Cpn0797蛋白二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主；成功地建立了能穩(wěn)定分泌抗Cpn0797蛋白的單克隆抗體雜交瘤細胞株，單克隆抗體能特異性的識別Cpn0797內(nèi)源性蛋白。結(jié)論成功制備特異性的Cpn0797單克隆抗體，為進一步探究Cpn0797蛋白的生物學(xué)功能提供實驗基礎(chǔ)。

肺炎嗜衣原體；Cpn0797；生物信息學(xué)；單克隆抗體

肺炎嗜衣原體（Chlamy dophila pneumoniae，Cpn）是一種嚴(yán)格細胞內(nèi)寄生、具有獨特發(fā)育周期的病原微生物，其感染不僅可引起肺炎、支氣管炎和咽炎等呼吸道疾?。?］，而且還與動脈粥樣硬化等心血管疾病密切相關(guān)［2－4］。病原菌和宿主相互作用過程中，衣原體可通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）或其他分泌機制將本身的蛋白質(zhì)穿過真核細胞膜或包涵體膜而進入宿主細胞質(zhì)［5－8］或定位于包涵體膜上［9］，進而影響宿主細胞正常的新陳代謝和功能；衣原體蛋白酶（體）樣活性因子（chlamydial protease／proteasomelike activity factor，CPAF）［10－11］是首個被發(fā)現(xiàn)的衣原體分泌蛋白，被分泌至宿主細胞質(zhì)內(nèi)發(fā)揮著蛋白酶活性，降解宿主細胞的轉(zhuǎn)錄因子RFX5和上游刺激因子1（USF－1）而下調(diào)宿主細胞 MHC I、II類分子的表達水平，使衣原體逃避宿主的免疫識別；Cpn0796［5］、Cpn0797［12］、Cpn0809和 Cpn1020［7］等衣原體分泌蛋白陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，但是分泌蛋白在Cpn和宿主細胞的相互作用過程中所發(fā)揮的作用目前少見報道。

沙眼衣原體感染單核細胞后可通過激活NLRP3炎性復(fù)合體（inflammasome）而刺激caspase－1活化，進而導(dǎo)致促炎細胞因子IL－1β的成熟和分泌［13］，其可能的分子機制是沙眼衣原體T3SS效應(yīng)蛋白等衣原體分泌蛋白作為胞內(nèi)危險信號分子促進細胞內(nèi)K＋外流、或?qū)е录毎麅?nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平升高，進而調(diào)控NLRP3炎性復(fù)合體的激活。Cpn感染也可通過激活NLRP3炎性復(fù)合體而促進IL－1β的分泌［14］，Cpn分泌蛋白是否在其中發(fā)揮作用，尚不清楚。

本研究利用生物信息學(xué)分析Cpn0797蛋白的結(jié)構(gòu)；利用基因重組技術(shù)表達Cpn0797融合蛋白，并且制備了特異性的單克隆抗體，為進一步認識Cpn0797等Cpn分泌蛋白在衣原體與宿主細胞的相互作用過程中的分子機制提供實驗工具。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株 Cpn標(biāo)準(zhǔn)株AR39由美國得克薩斯大學(xué)圣安東尼奧醫(yī)學(xué)科學(xué)中心（UTHSCSA）鐘光明教授實驗室保存。

1．1．2 主要試劑 Glutathione Sepharose 4B純化試劑購自Amersham Biosciences公司；弗氏完全佐劑、不完全佐劑，聚乙二醇（PEG），HAT和 HT選擇性培養(yǎng)基為Sigma公司產(chǎn)品；兔抗Cpn抗體R12AR39由鐘光明教授實驗室制備并保存，Cy2－標(biāo)記的羊抗兔Ig G、Cy3－標(biāo)記的羊抗鼠IgG和Cy3－標(biāo)記的羊抗鼠IgG 亞類抗體 （IgG1、IgG2a、IgG2b，IgG3）購自Jackson ImmunoResearch公司。

1．1．3 實驗動物 BALB／c小鼠由 UTHSCSA實驗動物部提供和飼養(yǎng)。

1．2 方法

1．2．1 一般生物信息學(xué)分析 利用ExPASy Proteomics tools （http：／／www．expasy．org／tools／）的ProtParam程序進行氨基酸序列組成、分子量、等電點等理化性質(zhì)分析；用SignalP 3．0在線軟件（http：／／www．cbs．dtu．dk／services／SignalP／）預(yù)測蛋白的信號肽；應(yīng)用NPS＠ 服務(wù)器 （http：／／npsapbil．ibcp．fr／）中的PHD 程序在線分析α螺旋、β轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲及延伸鏈等；用PSORT軟件（http：／／psort．hgc．jp／）中的 PSORT－B Prediction工具進行蛋白亞細胞定位預(yù)測。

1．2．2 GST－Cpn0797融合蛋白的表達與純化 構(gòu)建p GEX6p－2／cpn0797重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1Blue，提取質(zhì)粒測序鑒定。將鑒定后的單個陽性克隆菌落接種于20 m L含氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，次日按1%比例轉(zhuǎn)種于400 m L含氨芐青霉素的TB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600值達0．6～0．8時，加入IPTG至終濃度為200μmol／L，30℃誘導(dǎo)表達3 h后4℃7 000 r／min離心10 min收集菌體沉淀，將菌體重懸于預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的20 m L裂解緩沖液，4℃超聲裂菌后，低溫高速離心20 min，取上清與PBS預(yù)平衡的Glutathione Sepharose 4B Beads在室溫轉(zhuǎn)動吸附1 h，低速離心棄上清，經(jīng)0．25%PBST和PBS洗滌后得到純化的融合蛋白，分裝保存。取10μL純化的產(chǎn)物進行SDS－PAGE分析。

1．2．3 動物免疫和細胞融合 將純化的GSTCpn0797融合蛋白與等體積弗氏完全佐劑超聲乳化后，腹腔注射免疫6w齡BALB／c小鼠，初次免疫14 d后，每隔10 d用融合蛋白弗氏不完全佐劑加強免疫3次，第4次免疫7 d后，小鼠尾靜脈采血，分離血清獲得多克隆抗體，間接免疫熒光法（IFA）檢測免疫效果；將不加佐劑的GST－Cpn0797融合蛋白腹腔注射進行沖擊免疫，3 d后斷頸法處死小鼠，無菌分離脾細胞。將免疫脾細胞與SP2／0細胞按10∶1比例混合，1 500 r／min離心5 min后棄上清，沉淀細胞在50%的PEG作用下于37℃進行細胞融合，融合后細胞懸浮于20%胎牛血清－HAT－DMEM培養(yǎng)液中，按200μL／孔轉(zhuǎn)移至96孔細胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 w左右觀察克隆的形成，將克隆細胞轉(zhuǎn)移至24孔細胞培養(yǎng)板進行擴大培養(yǎng)。

1．2．4 陽性克隆的篩選及克隆化 應(yīng)用IFA篩選陽性克隆，Cpn標(biāo)準(zhǔn)株AR39感染HeLa細胞90h后，采用4%多聚甲醛（PF）室溫固定1 h，2%皂角苷（Saponine）室溫作用1h進行打孔處理，PBS洗滌后用含10%FBS的DMEM室溫封閉，一抗用兔抗Cpn抗體R12AR39、雜交瘤細胞培養(yǎng)上清雙染色，37℃孵育1 h；充分洗滌后加入二抗，二抗采用Cy2標(biāo)記的羊抗兔IgG和Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG，Hoechst標(biāo)記細胞核，37℃孵育1 h后充分洗滌，從24孔細胞培養(yǎng)板中取出蓋玻片置于載玻片上，封閉液固定后熒光顯微鏡觀察結(jié)果。應(yīng)用有限稀釋法對陽性克隆連續(xù)亞克隆，并進行放大培養(yǎng)，收集細胞培養(yǎng)上清，低溫保存。

1．2．5 Ig類別及亞類的鑒定 應(yīng)用IFA進行Ig類別及亞類的鑒定，方法同前，不同之處在于以Cy3標(biāo)記的羊抗鼠IgG1、Ig G2a、IgG2b、IgG3抗體為二抗進行免疫熒光染色。

1．2．6 m Ab特異性的鑒定 用原核表達純化的GST－Cpn0797、GST－Cpn0796N融合蛋白分別與細胞培養(yǎng)上清在室溫轉(zhuǎn)動吸附1h，離心收集上清后，應(yīng)用IFA進一步觀察經(jīng)吸附后的細胞培養(yǎng)上清的染色情況。

2 結(jié) 果

2．1 Cpn0797蛋白一般生物學(xué)特征 ProtParam分析顯示Cpn0797蛋白由365個氨基酸殘基組成，分子式為C1697H2650N468O537S7，理論分子量為38．4 k Da，理論等電點（p I）為5．56；酸性氨基酸殘基總數(shù)（Asp＋Glu）為43，堿性氨基酸殘基總數(shù)（Arg＋Lys）為32；不穩(wěn)定系數(shù)（instability index，Ⅱ）為26．93，表明此蛋白性質(zhì)穩(wěn)定；其親疏水性平均值（Grand average of hydropathicity，GRAVY）為－0．112，表明其為親水性蛋白。應(yīng)用SignalP 3．0在線軟件分析蛋白的信號肽，結(jié)果表明N端含有23個氨基酸的信號肽序列，見圖1。

圖1 SignalP－NN對Cpn0797信號肽的預(yù)測Fig．1 The signal peptide prediction of Cpn0797 by SignalP－NN

通過PSORT軟件分析未能成功地預(yù)測Cpn0797蛋白在細胞內(nèi)的定位。

應(yīng)用NPS＠ 服務(wù)器中的PHD程序在線分析Cpn0797蛋白的二級結(jié)構(gòu)，提示其二級結(jié)構(gòu)由6．58%α－螺旋（Alpha helix，Hh）、37．81%延伸鏈（Extended strand，Ee）、55．62%無規(guī)則卷曲（Random coil，Cc）構(gòu)成，見圖2。α－螺旋位于氨基酸序列的氨基端；該蛋白不易形成β－轉(zhuǎn)角。

圖2 Cpn0797蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig．2 Secondary structure prediction of Cpn0797 Note：h：Alpha helix；e：Extended strand；c：Random coil

2．2 GST－Cpn0797融合蛋白的表達與純化

pGEX6p－2／cpn0797陽性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，采用Glutathione Sepharose 4B純化試劑純化目的蛋白，得到可溶性的融合蛋白，經(jīng)SDS－PAGE檢測顯示在相對分子質(zhì)量50 k Da與90 k Da處可見一清晰蛋白條帶，與預(yù)測融合蛋白分子量基本相符（GST相對分子質(zhì)量為26 k Da，Cpn0797相對分子質(zhì)量約38．4 k Da）。

2．3 分泌抗Cpn0797蛋白m Ab的雜交瘤細胞的建立 以純化的GST－Cpn0797融合蛋白免疫BALB／c小鼠，經(jīng)雜交瘤技術(shù)建立雜交瘤細胞株，以Cpn感染細胞后所表達的內(nèi)源性蛋白為抗原借助IFA鑒定陽性雜交瘤細胞克隆，共獲得2株分泌抗Cpn0797蛋白m Ab的雜交瘤細胞。雜交瘤細胞液氮凍存、復(fù)蘇后，仍然可穩(wěn)定分泌m Ab。

圖3 GST－Cpn0797融合蛋白純化產(chǎn)物的SDS－PAGE分析Fig．3 SDS－PAGE analysis of purified GST－Cpn0797 fusion protein Note：1．Protein marker；2，3．purified GSTCpn0797 fusion protein（64k Da）

2．4 抗Cpn0797蛋白m Ab的亞類鑒定 IFA檢測抗Cpn0797單克隆抗體的亞類，結(jié)果表明2株m Ab均為IgG2a。

2．5 IFA鑒定抗Cpn0797蛋白m Ab的特異性IFA結(jié)果顯示：抗Cpn0797蛋白m Ab與GSTCpn0797融合蛋白吸附后不能識別Cpn0797內(nèi)源性蛋白，細胞質(zhì)特異性染色消失（圖4B），而與非特異性GST－Cpn0796N融合蛋白吸附后，未發(fā)現(xiàn)有交叉反應(yīng)，仍然可見GST－Cpn0797抗體的細胞質(zhì)染色特征（圖4C）。

圖4 間接免疫熒光法檢測mAb的特異性Fig．4 Detection of the specificity of mAb by using an indirect immuno fluorescence assay Note：C．pneumoniae－infected HeLa cells were processed for immunostaining with m Ab visualized with a goat antimouse IgG conjugated with Cy3（red）．A rabbit anti－chlamydia organisms antiserum plus Cy2－conjugated goat anti－rabbit IgG（green）was used to visualize the C．pneumoniae，and the DNA Hoechst stain（blue）．The m Ab anti－Cpn0797 detected strong cytosolic signals（A）．The cytosolic signals detected by the anti－Cpn0797 m Ab was removed by preabsorption of m Ab with the GST－Cpn0797 fusion protein（B）but not GST－Cpn0796N fusion protein（C）

3 討 論

在感染宿主細胞過程中，衣原體借助原體（EB）附著于易感細胞表面，通過胞吞作用進入細胞內(nèi)形成包涵體，在包涵體內(nèi)完成EB→RB（網(wǎng)狀體）→EB的獨特發(fā)育周期。在發(fā)育周期過程中根據(jù)衣原體蛋白在包涵體上的分布情形，可將衣原體蛋白區(qū)分為幾種類型：包涵體蛋白，分布于EB和／或RB上；包涵體膜蛋白（inclusion membrane protein，Inc蛋白），借助T3SS或其他分泌機制而分布于包涵體膜上；分泌蛋白，借助T3SS或其他分泌機制而分布于宿主細胞質(zhì)。分泌蛋白CPAF在衣原體各種之間均有其同源蛋白［15］；Cpn0796、Cpn0797蛋白是 Cpn的特異性蛋白，在衣原體其他種內(nèi)未發(fā)現(xiàn)同源蛋白，Cpn0796通過自主轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)（autotransporter）將其氨基端（Cpn0796N）分泌至宿主細胞質(zhì)［5］，Cpn0797蛋白與Cpn0796N具有一定的同源性，SignalP預(yù)測在其氨基端均具有信號肽序列，PSORT軟件分析未能成功地預(yù)測Cpn0797蛋白在細胞內(nèi)的定位，預(yù)測概率不是100%，所以關(guān)于Cpn0797蛋白在Cpn感染細胞內(nèi)的定位，需要實驗進一步驗證。董峰［12］等已證實Cpn0797蛋白是Cpn的分泌蛋白，根據(jù)Cpn0797蛋白與Cpn0796N蛋白結(jié)構(gòu)的相似性，提示Cpn0797蛋白的分泌機制可能也是自主轉(zhuǎn)運蛋白系統(tǒng)。

NPS＠PHD程序分析Cpn0797蛋白的二級結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲所占比例高達55．62%，提示可能具有多個抗原表位。本研究利用基因重組技術(shù)表達了可溶性GST－Cpn0797融合蛋白，為抗體的制備提供了抗原；因GST基因與衣原體基因沒有同源性，以衣原體感染細胞后所表達的內(nèi)源性蛋白為抗原篩選單克隆抗體，能消除針對GST抗原的單克隆抗體雜交瘤細胞株的干擾，較好地篩選到針對于衣原體自身蛋白抗原的雜交瘤細胞株。

Cpn0797蛋白單克隆抗體特異性的分析：用原核表達純化的GST－Cpn0797融合蛋白與細胞培養(yǎng)上清孵育吸附后，IFA染色檢測Cpn感染細胞細胞質(zhì)染色消失，用GST－Cpn0796N融合蛋白吸附后仍然可見細胞質(zhì)染色特征，這符合Cpn0797蛋白在Cpn感染細胞內(nèi)的定位分布［11］，進一步說明該抗體是針對Cpn0797蛋白特異性表位的特異性m Ab。本研究制備的抗Cpn0797蛋白特異性的m Ab，為后續(xù)認識Cpn0797等分泌蛋白在衣原體與宿主細胞之間的相互作用過程中的機制提供了有力的實驗工具。

（本研究部分實驗在美國UTHSCSA鐘光明教授實驗室完成，感謝鐘教授的實驗指導(dǎo)和幫助）。

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Bioin formatic analysis of Chlamydo phila pneumoniae Cpn0797 protein and the preparation of its monoclonal antibody

CHEN Chao－qun，WU Yi－mou，REN Lin，LIU Liang－zhuan

（Department of Microbiology and Immunology，Institute of Pathogenic Biology，School of Medicine，University of South China，Hengyang 421001，China）

In order to analyze the protein structure of Chlamydophila pneumoniae Cpn 0797 protein and to prepare specific monoclonal antibodies（m Ab）against Cpn0797 protein，ProtParam，SignalP，NPS＠and PSORT software packages were used to predict the physical and chemical properties，signal peptide，secondary structure and protein localization sites in cells according to the amino acid sequence of Cpn0797．The gene cpn0797 was cloned into the prokaryotic expression vector p GEX6p－2，and expressed in E．coli and then purified．The m Abs against Cpn0797 were prepared with the hybridoma technique after mice were immunized with purified GST－Cpn0797 fusion protein．The isotype and specificities of the m Abs were determined by indirect immuno fluorescence assay（IFA）．The bioin formatical analysis results showed that Cpn0797 protein mainly consisted of random coils．Hybridoma cell lines stably secreting m Abs against Cpn0797 protein are obtained．The m Abs reacted with Cpn0797 endogenous protein．In conclusion，the specific m Abs against Cpn0797 protein were obtained，which provides a basis for further study in the biological function of Cpn0797 protein．

Chlamydophila pneumoniae；Cpn0797；bioinformatics；monoclonal antibody

R374＋．3

A

1002－2694（2012）02－0103－05

＊國家自然科學(xué)基金 （No．81072417）和湖南省衛(wèi)生廳科研課題（B2007093）聯(lián)合資助

吳移謀，Email：yimouwu＠sina．com

1．南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)與免疫學(xué)教研室，病原生物學(xué)研究所，衡陽 421001；2．南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，衡陽 421001

2011－09－14；

2011－11－16