黨榮理，任立松，高金拽，馬德新，劉小明

恙蟲病是經(jīng)媒介恙螨叮咬而傳給人的一種自然疫源性疾病，其病原體為恙蟲病東方體（Orientia tsutsugamushi，Ot），以鼠類為主要傳染源或儲存宿主。恙蟲病主要發(fā)生于長江以南地區(qū)，近年來恙蟲病疫情有所變化，在北方地區(qū)也出現(xiàn)恙蟲病疫情報(bào)告［1］。我們于2008年4月至8月份對新疆博樂地區(qū)的動物感染恙蟲病東方體的情況進(jìn)行了調(diào)查［2］，隨后在2009年到2010年間分別對可疑地區(qū)的牧民、動物宿主、傳播媒介等進(jìn)行了全面的調(diào)查，結(jié)果顯示在新疆博樂地區(qū)存在恙蟲病東方體自然疫源地，現(xiàn)將調(diào)查情況報(bào)告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 脾取自捕獲的野鼠，血液取自可疑地區(qū)當(dāng)?shù)啬撩耢o脈血，媒介恙螨從捕獲的野鼠體表獲得。昆明種小白鼠購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級實(shí)驗(yàn)室。

1．2 主要試劑EasyPureGenomic DNA Extraction Kit、2×EasyTaq PCR SuperMix、Marker2000（購自北京全式金生物技術(shù)有限公司），PCR凝膠回收試劑盒（購自美國Omega公司）。實(shí)驗(yàn)其他試劑均購自上海生工。

1．3 引物 參照Furuya［3］及 Tamura［4］設(shè)計(jì)的 Otsta M型特異引物，包括外引物和內(nèi)引物，其中內(nèi)引物分為群特異引物和型特異引物，由Invitrogene生物技術(shù)有限公司合成。引物序列及大小見表1。

表1 引物序列Tab．1 The sequences of primers

1．4 方法

1．4．1 媒介恙螨調(diào)查 采用檢查宿主法［5］，將捕回的野鼠處死后，齊耳根剪下鼠耳，翻出耳窩，放大鏡觀察，用稍濕細(xì)毛筆挑入70%乙醇浸濕的指形管內(nèi)，待查。根據(jù)調(diào)查結(jié)果計(jì)算帶螨率及帶螨指數(shù)。

1．4．2 恙螨種類鑒定 按照孟春陽等［6］提供方法，進(jìn)行標(biāo)本制做及種類鑒定。

1．4．3 Ot分離按照唐家琪［5］提供方法，進(jìn)行病原接種、分離及鑒定。

1．4．4 標(biāo)本DNA提取無菌條件下取鼠、旱獺脾組織約25mg左右（血液約100μL，恙螨約90～100只左右），切碎，置于無菌1．5mL離心管中，按照TransGen Biotech基因提取試劑盒操作步驟提取總DNA，－20℃冰柜保存待用。

1．4．5 nPCR反應(yīng) 第1次PCR使用引物P34和P55，擴(kuò)增體系為：Super－Mix 13μL、DNA 模板1μL、P55 0．5μL、P34 0．5μL、蒸餾水10μL，擴(kuò)增條件為：94℃5min，94℃30s，57℃2min，70℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。第2次PCR將引物改為P10和P11，用第1次PCR產(chǎn)物為模板，其他反應(yīng)成分及條件同第1次PCR。取第2次PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，有481～507bp帶者為陽性。

1．4．6 基因分型及序列同源性分析 分型引物的合成（表1），PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件同1．4．5條件。根據(jù)nPCR結(jié)果，將擴(kuò)增產(chǎn)物的純化及序列測定采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒，按說明書從凝膠中回收nPCR產(chǎn)物。將純化回收的PCR產(chǎn)物送上海生工測序。測序結(jié)果登陸美國國家生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站http／／ww／／w．ncbi．nlm．nih．gov／，與 Gen－Bank中注冊的序列進(jìn)行比較。

2 結(jié) 果

2．1 媒介調(diào)查結(jié)果 在平原濕地、居民區(qū)、山地草原共捕鼠154只，主要包括：小家鼠38只、普通倉鼠53只、大沙土鼠46只、草原跳鼠17只，從其中13只鼠體表分離到恙螨817只，帶螨率為8．4%。恙螨經(jīng)鑒定包括2個(gè)種：博樂纖恙螨（Leptotrombidium．bolei）和新疆纖恙螨（Leptotrombidium．xinjiangensis）。

2．2 病原分離結(jié)果 陽性鼠脾懸液腹腔接種1周后，發(fā)現(xiàn)昆明種小白鼠出現(xiàn)閉目、聳毛現(xiàn)象，未出現(xiàn)死亡。無菌取脾再制成懸液，進(jìn)行傳代接種，1周后接種鼠出現(xiàn)同樣癥狀，無菌取脾，按照1．4．4、1．4．5方法步驟，提取DNA，檢測Ot，結(jié)果顯示，傳代2次后，從接種鼠脾中檢測到Ot陽性（圖1），判斷成功分離到恙蟲病東方體。

圖1 傳代鼠脾電泳圖1：Marker；2：傳代鼠脾擴(kuò)增結(jié)果Fig．1 Electrophoresis on subculturing spleen of mice1：Marker；2：Amplification results for culturing spleen of mice．

2．3 nPCR結(jié)果 在平原濕地、居民區(qū)中捕獲的3類（小家鼠、普通倉鼠、大沙土鼠）脾提取的總DNA中擴(kuò)增出481－507bp大小的條帶，在山地草原捕獲的草原跳鼠脾的總DNA中未擴(kuò)增到陽性帶，總的陽性率為4．5%。牧民靜脈取血，提取血液中總DNA，從3份中擴(kuò)增到481－507bp條帶，陽性率為1．9%。推測感染人群未發(fā)病可能與病原毒性較弱有關(guān)。從博樂纖恙螨的總DNA中擴(kuò)增到目的片段，未從新疆纖恙螨的總DNA中擴(kuò)增到目的帶（見圖2）。

圖2 nPCR結(jié)果M：Marker，1：平原濕地及居民區(qū)鼠脾陽性總DNA擴(kuò)增結(jié)果；2：牧民血液陽性總DNA擴(kuò)增結(jié)果；3：博樂纖恙螨總DNA擴(kuò)增結(jié)果Fig．2 nPCR results M：Marker；1：Positive amplification results for total DNA of spleen of mice in plain wetlands and residential areas；2：Positive amplification results for total DNA of blood from herdsmen；3：Amplification results for total DNA of Leptotrombidiumbolei

2．4 基因分型結(jié)果 從鼠脾、人血、博樂纖恙螨提取的總DNA經(jīng)基因分型引物擴(kuò)增后，僅在Karp株引物管中有230bp左右的擴(kuò)增帶（圖3）。

2．5 測序及同源性分析結(jié)果 經(jīng)上海生工測序，核苷酸長度均為442bp。將分離株的核苷酸序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示與Karp株的核苷酸序列同源性為97%（圖4），與ISS－11、Taiwan序列的同源性為97%；與Kanda的核苷酸序列同源性為92%。BLAST結(jié)果與基因分型引物擴(kuò)增結(jié)果相同。

圖3 基因分型結(jié)果1：Marker；2：Gllima株引物；3：Karp株引物4：Kato株引物；5：Kuroki株引物；6：Saitama株引物；7：Kawasaki株引物Fig．3 Genotyping1：Marker；2：Primer of Gllima strain；3：Primer of Karp strain；4：Primer of Kato strain；5：Primer of Kuroki strain；6：Primer of Saitama strain；7：Primer of Kawasaki strain．

3 討 論

1952年我國開始有恙蟲病的疫情報(bào)告，至1985年每年約有1 000例病例報(bào)告，隨后疫情有所平息，到1994年疫情回升，而且發(fā)病人數(shù)呈增多態(tài)勢［7］。疫區(qū)范圍發(fā)生變化，1985年我國恙蟲病僅在北緯31°以南的廣大地區(qū)流行，流行范圍東至臺灣，西至云南，北至浙江和湖南諸省區(qū)，南至海南及兩廣地區(qū)。1986年以后，恙蟲病疫源地逐步北移，1986年至1998年間分別在山東、江蘇、吉林、甘肅、河北等省均發(fā)現(xiàn)恙蟲病病例［1］。

新疆博樂地區(qū)以農(nóng)牧區(qū)為主，植被復(fù)雜，生境多樣，有高原草場、湖泊濕地，其生境特點(diǎn)較為適合恙蟲病東方體的生存。上世紀(jì)70年代宗定國等［8］在新疆博樂地區(qū)的牧民、綿羊、鼠類的血清中檢測到Ot抗體，2008年黨榮理等在新疆地區(qū)鼠類脾樣本中利用分子生物學(xué)方法擴(kuò)增到Ot陽性片段。但由于未能分離到病原、確定傳播媒介，對該地區(qū)恙蟲病東方體的自然疫源地特征始終存在諸多疑問。本課題組在前期對該地區(qū)動物感染恙蟲病東方體調(diào)查的基礎(chǔ)上，從捕獲的野鼠的體表分離恙螨，對恙螨進(jìn)行了種類鑒定，同時(shí)，對Ot檢測為陽性的鼠脾進(jìn)行接種傳代，分離病原。

恙螨的鑒定結(jié)果顯示，該地區(qū)主要存在2種恙螨，分別為博樂纖恙螨（L．bolei）和新疆纖恙螨（L．xinjiangensis）。通過提取DNA，nPCR擴(kuò)增Ot陽性片段，顯示從博樂纖恙螨（L．bolei）的總DNA中擴(kuò)增到目的片段，由此判斷在該地區(qū)恙蟲病東方體的傳播媒介可能為博樂纖恙螨（L．bolei）。nPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示從鼠脾、牧民血液、恙螨的總DNA中擴(kuò)增到Ot陽性片段，基因序列分析及同源性分析表明，在該地區(qū)恙蟲病東方體的基因型為KARP株型。在前期研究過程中，我們分別從該地區(qū)鳥類的脾臟、綿羊血液中均擴(kuò)增到了Ot陽性片段，其基因型也均為Karp型，推測新疆博樂地區(qū)恙蟲病東方體的基因型比較單一，但宿主動物呈現(xiàn)多樣性特點(diǎn)。從山地草原捕獲草原跳鼠17只，從體表未分離到恙螨，基因檢測結(jié)果為陰性。結(jié)合以前的檢測結(jié)果，推測在博樂地區(qū)的恙蟲病東方體的疫源地可能存在于平原濕地和城鄉(xiāng)結(jié)合地區(qū)。

本研究結(jié)果與宗定國等［8］的有一定差異，主要體現(xiàn)在宿主動物、傳播媒介、感染率等方面。宗定國等［8］通過補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，判斷在該地區(qū)的恙蟲病東方體的主要宿主動物為長尾黃鼠；傳播媒介為恙螨，但對恙螨的種類未予以確認(rèn)；人群感染率為20．1%，野鼠感染率為8．9%；未分離到病原。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)?shù)仨οx病東方體的宿主動物有小家鼠、普通倉鼠、大砂土鼠，在鳥類中檢測到Ot陽性；傳播媒介為博樂纖恙螨；野鼠感染率為5．5%，人群感染率為2．0%。其差異可能與環(huán)境變化有關(guān)，以此次調(diào)查的地點(diǎn)之一艾比湖灘涂地區(qū)為例，與上世紀(jì)80年代相比湖面縮小了近1／3，湖邊濕地沙化嚴(yán)重，植被、動物種類等均發(fā)生了變化，這些都可能造成恙蟲病東方體的生存空間變化，隨之引起宿主和感染率變化。

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