邢佑尚 汪 琳 趙胤澤 王慧珊

(1.沈陽農業(yè)大學遼寧沈陽110886;2.北京出入境檢驗檢疫局)

1 前言

抗體庫(antibody library)技術是用PCR技術得到抗體全套重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，將得到的目的片段重組到特定的表達載體中，最后轉入原核或真核生物體內以表達有功能的抗體分子片段，并通過親和篩選獲得特異性抗體的技術?？贵w表型與基因型的統(tǒng)一，從構建的抗體庫中找到編碼針對特異抗原的基因是抗體庫技術的核心內容［1］?？贵w庫技術的產(chǎn)生基于三項關鍵技術的突破:一是PCR技術使人們能夠利用引物得到全套抗體相關可變區(qū)基因;二是利用大腸桿菌表達出了具有特異抗原抗性的重組抗體分子;三是噬菌體表面重組蛋白展示技術的成功建立［2］?？贵w庫技術較傳統(tǒng)細胞融合雜交瘤技術制備單抗有著天然技術上的縮短抗體制備周期的優(yōu)勢，跳過了雜交瘤細胞融合步驟而自然避免了因雜交瘤細胞丟失和不穩(wěn)定問題;擴大了篩選容量，將抗體庫的克隆基數(shù)一般在106以上，遠超雜交瘤細胞;抗體庫技術制備的抗體是表型和基因型的統(tǒng)一，便于進一步構建各種基因工程抗體;抗體庫技術得到的抗體可利用原核表達系統(tǒng)的優(yōu)勢表達;一些針對弱免疫原、毒性抗原、人源抗體等難于制備的抗體都可以得到解決?？贵w庫技術由于通最高、周期短、可控性好、路線多樣，因而成為開發(fā)抗體最具發(fā)展活力的領域［3］。

根據(jù)抗體庫展示平臺的不同可以分為:噬茵體展示、核糖體展示、酵母展示、細菌展示、桿狀病毒展示和哺乳細胞展示。不同的展示平臺具有各自的優(yōu)缺點，其中噬菌體抗體庫以噬菌體和細菌為對象，易操作，成本較低.是技術最成熟、商業(yè)應用最成功的展示平臺［4］。

2 噬菌體抗體庫技術

噬菌體抗體庫展示技術是一種用于蛋白質或抗體篩選的新技術，其基本原理是將外源DNA片段插入噬菌體編碼蛋白基因中，使外源DNA片段的表達產(chǎn)物與噬菌體的外殼蛋白融合，展示于噬菌體表面［5］。噬菌體展示技術的第一次出現(xiàn)是1985年，Smith G P將外源基因插入絲狀噬菌體f1的基因Ⅲ，在噬菌體表面展示了以融合蛋白形式表達的目的基因編碼的多肽。1988年Parmley將已知抗原決定簇與噬菌體PⅢ N端融合呈現(xiàn)在其表面。1990年Mc Cafferty用噬菌體展示技術篩選溶菌酶的單鏈抗體成功，開創(chuàng)了噬菌體展示技術廣泛應用的時代［6］。

2.1 噬菌體抗體庫所用的噬菌體

噬菌體展示技術中常用的噬菌體為溶原性的絲狀噬菌體，如M13、f1和fd，這些噬菌體為圓柱型，具有約6.5nm的直徑，它的長度則由基因組的大小決定如Fd噬菌體長930nm，而只有221個核苷酸的微噬菌體變種則只有50nm長，它的外殼蛋白包裹在噬菌體的外部。噬菌體主要外殼蛋白為 gⅧ蛋白，共有2700個拷貝。噬菌體的一端有gⅢ和gⅥ蛋白蛋白，主要作用是感染革蘭陰性菌;另一端有gⅦ和gⅨ蛋白，這4種蛋白在噬菌體中均有5個拷貝［7］。除了絲狀噬菌體外，其他的溶菌性噬菌體如λ噬菌體、T4、T7噬菌體也有應用。這些噬菌體可用于cDNA文庫的展示，尤其是T7噬菌體，近些年來應用越來越廣泛，將目的基因與T7外殼蛋白的基因融合，可在 T7表面展示高達400拷貝的大分子量蛋白質。

2.2 噬菌體抗體庫所用的衣殼蛋白

噬菌體抗體庫所用的衣殼蛋白有絲狀噬菌的PⅢ蛋白、PⅧ蛋白和PⅥ蛋白，λ噬菌體的PV蛋白和D蛋白以及T4噬菌體的SOC(9 ku)和HOC(40 ku)外殼蛋白。

2.2.1 PⅧ蛋白展示系統(tǒng)

絲狀噬菌體的主要衣殼蛋白PⅧ蛋白在噬菌體顆粒中存在幾千個拷貝。PⅧ蛋白展示的好處是拷貝數(shù)多，展示的抗體遍布于噬菌體的表面，PⅧ僅有50個氨基酸，抗體所受空間位阻小，特異性結合力強。PⅧ的N端附近可融合6－8個殘基的短肽，但不能融合更長的肽鏈，因為較大的多肽或蛋白會造成空間障礙，影響噬菌體裝配［8］，使其失去感染力，但有輔助噬菌體參與時，可提供野生型PⅧ蛋白，降低價數(shù)，此時可融合多肽甚至抗體片段。Sidhu，SS等使用經(jīng)過改造的PⅧ蛋白在多拷貝的情況下表達了更大的多肽［9］。

2.2.2 PⅢ蛋白展示系統(tǒng)

PⅢ蛋白展示系統(tǒng)是絲狀噬菌體的另一展示系統(tǒng)，同時也是噬菌體展示最受歡迎的展示系統(tǒng)，其以5個拷貝數(shù)量展示于病毒顆粒末尾，并且它能允許大片段的插入能與單價展示相容，有大量使用的載體。PⅢ有2個位點可供外源序列插入，PIII很容易為蛋白水解酶水解。所以有輔助噬菌體超感染時.可以使每個噬菌體平均顯示不到一個融合蛋白，稱為單價噬茵體，從而使抗體部分最大限度地保持原構型而功能完好。PIII展示系統(tǒng)的主要用途是制備噬茵體抗體，它的突出優(yōu)點是模擬了自然免疫選擇系統(tǒng)。此外，尚有絲狀噬菌體PⅥ展示系統(tǒng)的研究報道［10］。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌體表面，可以作為外源蛋白的融合位點，可以用于研究外源蛋白C端結構區(qū)域功能，該系統(tǒng)主要用于cDNA表面展示文庫的構建，并取得了不錯的篩選效果。

2.2.3 PV蛋白和D蛋白展示系統(tǒng)

PV蛋白和D蛋白都是λ噬菌體蛋白，λ噬菌體的尾部管狀部分主要由PV蛋白構成，用于表達的外源序列插入或替換PV兩個折疊區(qū)域中C端的折疊結構域(非功能區(qū))，λ噬菌體PV蛋白展示的優(yōu)點是其裝配在細胞內進行，能夠展示難以分泌的肽或蛋白質。用PV蛋白系統(tǒng)已成功展示了有活性的大分子蛋白β－半乳糖苷酶(465 ku)和植物外源凝血素BPA(120 ku)等。D蛋白是λ噬菌體另外一種用于展示系統(tǒng)的蛋白，其以三聚體的形式突病毒顆粒的組裝可以在體內也可以在體外，體外組裝即是將D融合蛋白結合到λD－噬菌體表面，而體內組裝是將含D融合基因的質粒轉化入λD－溶源的大腸埃希菌菌種中，從而補償溶源菌所缺的D蛋白，通過熱誘導而組裝。該系統(tǒng)有一個很大的特點，噬菌體上D蛋白和融合蛋白的比例可通過宿主抑制tRNA活性加以調節(jié)，這對于展示那些對噬菌體裝配有損害作用的蛋白質時特別有用［11］。

2.2.4 SOC和HOC蛋白展示系統(tǒng)

T4噬菌體的兩種非必需外殼蛋白SOC(small outer capsid protein)和HOC(highly antigenic outer capsid protein)，其顯著特點是能夠將兩種性質完全不同的外源多肽或蛋白質融合而直接展示于T4噬菌體的表面，因此它表達的蛋白不需要復雜的蛋白純化，避免了因純化而引起的蛋白質變性和丟失。不需要分泌途徑，因而其表面展示多肽和蛋白質的范圍廣，很少受到限制。在DNA包裝被抑制時，T4噬菌體是雙股DNA噬菌體中唯一能夠在體內產(chǎn)生空衣殼的噬菌體(SOC和HOC也同時組裝)。因此，在用重組T4做疫苗時，它能在空衣殼表面展示目的抗原，這種缺乏DNA的空衣殼苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景［12］。

2.3 噬菌體抗體庫類型

2.3.1 非免疫噬菌體抗體庫

非免疫抗體庫不針對特定抗原，而是作為一個無偏向性的篩選平臺，因此必須具有很高的庫容最和多樣性［13］。按照抗體可變區(qū)基因來源，非免疫抗體庫分為天然抗體庫、部分隨機化抗體庫、完全隨機化抗體庫。

天然抗體庫的基因主要來源于B細胞，包括前、成熟、記憶B細胞，常從骨髓、脾、淋巴結、外周血中提取。獲取全套抗體基因引物設計思路通常有3種:一是在框架區(qū)FR1和FR4或J區(qū)(鉸鏈區(qū))設計引物，其缺點是引物區(qū)引入的氨基酸突變對抗體的親和力有潛在影響;二是利用RACE技術，其特異引物可針對C區(qū)或polyA區(qū)，用此方法也可獲得真實的V區(qū)序列，而且不易漏過可用的抗體基因，但操作繁瑣;三是在信號肽和C區(qū)設計引物，克隆后測序，再在FRl和FR4根據(jù)測序的結果設計引物，可獲得完全真實的V區(qū)序列，但信號肽序列變化較大，不易設計［14］。

部分隨機化抗體庫，是在某一天然抗體基因的基礎上保持抗體的大體結構不變，一般4個FR和CDRl、CDR2區(qū)不變，只針對最關鍵的CDR3區(qū)進行隨機化操作［15］。

完全隨機化抗體庫保留抗體的FR不變，對全部的CDR區(qū)隨機化合成。FR來源于已知的天然抗體基因或人工設計，要求具有很高的序列通用性且能夠適應多樣的CDR結構。完全隨機化抗體庫的多樣性最高，但同時也對庫容量有更高的要求，因此操作難度較高［16］。

2.3.2 免疫噬菌體抗體庫

免疫噬菌體抗體庫的抗體基因來源于使用抗原免疫過的個體，因此存在免疫偏向性，相比非免疫抗體庫較容易從該類抗體庫中篩選到針對某一抗原的特異性抗體。其存在的缺點是由于免疫本身的偏向性和限制性，制備針對弱抗原、自身抗原、毒性抗原的抗體比較困難，且某一特定的抗體庫只能產(chǎn)生針對特定抗原趨向的抗體，無法作為一個廣泛的技術平臺加以應用［17］。

2.4 噬菌體抗體庫分子類型

抗體庫技術產(chǎn)生的抗體以小分子抗體為主，根據(jù)抗體分子類型，可將抗體庠分為Fab庫、單鏈抗體(scFv)庫、微型抗體庫、單域抗體(single－domain antibody)庫、最小識別單位(MRU)庫等［18］。

Fab片段是由重鏈(VH－CH1)和輕鏈(VLCL)組成的異二聚體，片段大小為完整抗體的1/3。與其他小分子抗體相比，雖然體積較大，但是卻能夠最好地保留抗體的親和力，因而目前應用最為成功［19］。

單鏈抗體(scFv)是在抗體重鏈(VH)與輕鏈(VL)之間用連接肽(1inker)連接而形成，大小為完整抗體的1/6。(Gly4Ser)3為常用連接肽，具有較好的疏水性和伸展性，不影響抗原結合部位的構象。其優(yōu)點是分子量小，穿透力強，近年來scFv的應用趨于成熟。

單域抗體由VH或VL組成，大小為完整抗體的1/12。與VL相比，大多數(shù)單獨的VH保留了較好的抗原結合能力和專一性，然而由于暴露了原先與VL結合的疏水性，須改造其中的一些氨基酸位點。

3 噬菌體抗體庫在檢驗檢疫中的應用

目前世界各國間貿易量飛速增長，我國的出入境產(chǎn)品也迅猛增長，在此前提下，如何實現(xiàn)出入境產(chǎn)品的快速通關，實現(xiàn)我國大通關的戰(zhàn)略是亟待解決的問題。目前免疫檢測在檢測方法占據(jù)了極其重要的位置，得到了最為廣泛的應用，然而傳統(tǒng)免疫或雜交瘤等途徑獲得抗體費時費力，且無法滿足制備各種高密度大通量蛋白檢測的需要。新興的噬菌體抗體庫技術可以快速、廉價、高通量地獲得產(chǎn)量高，活性強，特異性好克隆抗體。研究者們?yōu)槭删w抗體庫用于檢測方面做了許多開創(chuàng)性研究。

在生物寄生蟲檢測方面，張慧林等利用經(jīng)日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原和成蟲抗原免疫的BALb/c小鼠脾臟作為cDNA來源，利用免疫噬菌體抗體庫技術得到抗體庫，然后分別以免疫鼠血清IgG和正常鼠血清IgG包板，將得到的抗體庫依次孵育后使用抗原篩選，進行六輪富集洗脫后，從最后一次篩選得到的細菌集落中隨機挑選80個克隆，用ELISA鑒定，將陽性克隆進行可溶性表達［20］，從上述庫中篩選獲得四株日本血吸蟲抗獨特型抗體，對其中一株(C12)進行了可溶性表達，用SDS－PAGE電泳初步鑒定，然后經(jīng) ELISA鑒定出四株(C12、C19、D1、D2)抗日本血吸蟲獨特型抗體。黃會、詹希美等成功的構建了庫容為3.46×106的鼠源性抗恙蟲病東方體的噬菌體Fab片段抗體庫，試驗以感染恙蟲病東方體小鼠的脾細胞中的RNA為模板逆轉錄后，PCR擴增出抗體輕鏈和重鏈目的基因，將表達載體pComb3和輕鏈目的片段進行雙酶切、連接，轉化入大腸桿菌XL1－blue，得到輕鏈庫;再對重鏈目的基因和輕鏈重組質粒進行雙酶切、連接，轉化入大腸桿菌XL1－blue，構建組合文庫，用輔助噬菌體VCSM13進行超感染。用恙蟲病東方體特異性抗原進行篩選，經(jīng)過4輪富集篩選，抗體庫中的目的抗體得以富集約160倍，并用ELISA法對其進行鑒定，得到了7 個陽性克?。?1］。

在轉基因產(chǎn)品檢測方面，王耘等利用噬菌體抗體庫技術篩選抗CrylAc蛋白單鏈抗體，為CrylAc蛋白蛋白檢測開辟了一條新的制備路線。其制備的抗體庫經(jīng)輔助噬菌體M13K07擴增后，系列稀釋測定其滴度為1.0×1017pfu/L，以CrylAc蛋白為抗原包被固相，經(jīng)4輪富集擴增過程后，挑取單克隆，用ELISA法測定特異性結合活性，并對其進行基因序列測定。經(jīng)過4輪篩選，獲得了2株能與CrylAc蛋白特異性結合的陽性克?。?2］，為CrylAc毒素蛋白檢測提供了條件。

在產(chǎn)品藥物殘留檢測方面，由于抗體檢測的簡便、快速、靈敏、價廉等優(yōu)點，噬菌體抗體庫技術具有很大的應用潛力。沈建忠等構建了庫容量為6.5×106噬菌體scFv單鏈抗體庫，經(jīng)過三輪富集后通過Phage－ELISA技術成功篩選出了9個抗慶大霉素噬菌體陽性克隆。鄭志明等應用噬菌體展示和重組抗體技術構建了庫容為1.3×106的抗諾氟沙星單鏈抗體庫，噬菌體中scFv插入率為90%，制備抗諾氟沙星單鏈抗體庫，篩選得到5株抗諾氟沙星的陽性克隆。為運用噬菌體展示抗體技術制備特異性抗藥物單抗及進一步建立藥殘檢測新技術奠定了基礎［23］。

鑒于噬菌體抗體庫技術的大容量性和生物芯片的高通量性，將噬菌體抗體庫技術和生物芯片技術相結合應用于檢測領域必將為檢驗檢疫工作帶來革命性的提高，在生物芯片檢測方面，人們最初嘗試了PⅢ展示系統(tǒng)制作的抗體檢測芯片，后來廖瑋等人比較了噬菌體PⅢ和PⅧ展示系統(tǒng)制作的凝血酶特異的單鏈抗體芯片，比較不同展示系統(tǒng)對噬菌體抗體芯片的特異性及靈敏度的影響，結果表明PⅧ展示系統(tǒng)陽性對照的熒光信號增加了PⅢ展示系統(tǒng)的26倍，而陰性抗原對照的熒光強度降低為PⅢ展示系統(tǒng)的1/65，作為對照的陰性噬菌體強度基本沒有變化，在PⅧ展示系統(tǒng)中，陽性對照與陰性抗原和陰性噬菌體的熒光強度比由原來的2:1:1提高為3000:1:50［24］。為解決噬菌體展示的展示效率低、拷貝數(shù)少和偶聯(lián)后噬菌體倒伏在芯片上的問題提供了解決方法，進一步為噬菌體抗體庫技術在抗體芯片的應用掃平了障礙。生物芯片技術的高通量特性結合抗體庫技術的高庫容特征，二者的結合為高密度高通量蛋白的檢測提供了有效地解決途徑。

在利用單重鏈噬菌體抗體庫方面，嚴安、孫冰玉等構建抗H5N1禽流感病毒的小羊駝免疫噬菌體重鏈可變區(qū)抗體庫(VHH型抗體庫)并從中篩選到了抗H5N1的噬菌體VHH型抗體，利用H5N1滅活疫苗免疫小羊駝四次后，其外周血清中抗體血清抑制效價可達1:2560，構建的VHH抗體基因庫庫容可達3×108，隨機挑選14個抗體基因克隆進行測序鑒定，結果顯示均為獨立克隆。上述基因庫經(jīng)輔助噬菌體拯救后，得到抗H5N1的噬菌體VHH型抗體初級庫，對初級庫進行血凝抑制試驗，結果呈陽性，表明初級庫中存在具有潛在中和活性的抗H5N1抗體［25］。

4 噬菌體抗體庫在檢驗檢疫中應用前景展望

綜上所述，噬菌體抗體庫技術在檢驗檢疫領域顯示出極大的應用前景，特別是噬菌體抗體庫的大容量、單體展示的特點為免疫檢測提供了比傳統(tǒng)雜交瘤細胞制作抗體更為方便、快捷、大批量的制備方法，結合近年來發(fā)展的高通量檢測技術平臺，如抗體固相芯片、懸浮芯片技術，可以為檢驗檢疫工作領域帶來突破性提高。如對于不同亞型的病毒檢測可以利用噬菌體抗體庫技術篩選對應不同亞型的單抗，然后制作高通量的亞型檢測芯片，將噬菌體抗體庫篩選的同一種屬不同亞型的抗體(Scfv/Fab)集中于一張芯片上，實現(xiàn)一次檢測排查所有已知此種病毒的目的。同時對于病毒變異快的問題，非免疫抗體庫技術提供了無傾向性抗體篩選平臺，無論病毒變異與否，都能篩選到合適的抗體，縮短應對病毒變異后抗體研制的時間。對于國內外突然爆發(fā)的疫情，以往要花費較長的時間進行相應抗體的獲得，應用噬菌體抗體庫技術的平臺可以很快獲得大量相應抗體，贏得應急反應時間。

噬菌體抗體庫技術應用于檢驗檢疫領域有著天然的鍥合優(yōu)勢和光明的前景，當然也存在一些技術瓶頸和需要完善的方面，庫容量是噬菌體抗體庫的優(yōu)勢但同時也是其技術瓶頸，一般庫容達到109以上，就能接近生物體內天然抗體基因的數(shù)量級，因此在保證庫容量的前提下應盡量提高庫的分子多樣性，這樣才能夠篩選到針對不同抗原的抗體。另外抗體庫產(chǎn)生的抗體親和力有待進一步改造提高，目前常用隨機進化策略如易錯PCR(error－prone PCR)、DNA 改組(DNA shuffling)、鏈交換、形態(tài)建成(morphogenics)等方法，以及定向進化策略如計算機模擬定點突變等提高抗體的親和力。

噬菌體抗體庫技術作為一種新的蛋白研究、抗體研制的方法，必將在檢驗檢疫領域的基礎研究和實際應用中產(chǎn)生深遠影響。

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