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        牛布氏桿菌試管凝集試驗(yàn)不確定度研究

        2012-09-17 08:20:40李冰玲馬貴平劉會(huì)英谷強(qiáng)劉全國(guó)李炎鑫史喜菊
        關(guān)鍵詞:濁度試管方差

        李冰玲 馬貴平 劉會(huì)英 谷強(qiáng) 劉全國(guó) 李炎鑫 史喜菊

        (1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 101113;2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利審查協(xié)作北京中心)

        1 前言

        試管凝集試驗(yàn)是微生物學(xué)檢驗(yàn)中常用的試驗(yàn)方法,即用已知細(xì)菌作為抗原液與一系列稀釋的受檢血清混合,保溫后根據(jù)試管內(nèi)抗原凝集程度和產(chǎn)生明顯凝集現(xiàn)象的血清最高稀釋度(血清中抗體的效價(jià)、滴度)來(lái)判斷動(dòng)物的感染狀態(tài),如對(duì)牛布氏桿菌病、馬流產(chǎn)病的血清學(xué)檢測(cè)。該試驗(yàn)還可通過(guò)已知抗血清來(lái)檢測(cè)未知病原,如對(duì)沙門(mén)氏菌和鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)和血清分型[1]。傳統(tǒng)的試管凝集試驗(yàn)為半定量試驗(yàn),當(dāng)被檢血清中含有目標(biāo)抗體時(shí),就會(huì)與溶液中的抗原發(fā)生反應(yīng),反應(yīng)物凝結(jié)沉降到管底,降低溶液的渾濁度,抗體濃度越高,溶液的渾濁度就越低。將待測(cè)管與事先配制好的比濁管進(jìn)行眼觀比較,可以得出待測(cè)血清的半定量結(jié)果(++++,+++,++,+,-)。為了評(píng)估試驗(yàn)結(jié)果的不確定度,本研究采用濁度計(jì)對(duì)反應(yīng)液的渾濁度進(jìn)行定量測(cè)定,得出濁度值(NTU),并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度分析。

        2 材料與方法

        2.1 材料

        2.1.1 試劑

        稀釋液:0.5%石炭酸生理鹽水(0.85%氯化鈉溶液,含0.5%石炭酸);牛布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗原、牛布氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、標(biāo)準(zhǔn)陰性血清:中國(guó)獸藥監(jiān)察所細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室提供。

        2.1.2 器材

        試管架;玻璃試管:規(guī)格為13 mm ×100 mm,圓底,潔凈;微量移液器:0-50 μL,0-200 μL,0-1000μL;濁度計(jì):上海昕瑞 WGZ-2000,量程0-2000 NTU。

        2.2 方法[2]

        2.2.1 被檢血清

        采用購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行倍比稀釋,稀釋起點(diǎn)為1:50,設(shè)定5個(gè)稀釋度。方法為:

        每份被檢血清用4支試管,標(biāo)記檢驗(yàn)編號(hào)后第1管加1.2 mL稀釋液和50μL被檢血清,第2-4管各加入0.5mL稀釋液;將第1管的稀釋液和被檢血清充分混勻后吸棄0.25 mL,然后吸取0.5mL加入到第2管,混合均勻后,再?gòu)牡?管吸取0.5 mL至第3管,如此倍比稀釋從最后一管棄去0.5 mL。

        2.2.2 加抗原

        將0.5 m L抗原(1:20)加入已稀釋好的各血清管中。各反應(yīng)管反應(yīng)總量為1 mL。

        2.2.3 設(shè)立對(duì)照

        每次試驗(yàn)都設(shè)立下列對(duì)照:

        陰性血清對(duì)照:陰性血清的稀釋和加抗原的方法與被檢血清同。

        陽(yáng)性血清對(duì)照:陽(yáng)性血清的最高稀釋度應(yīng)超過(guò)其效價(jià)滴度,加抗原的方法與被檢血清同。

        抗原對(duì)照:在0.5 mL稀釋液中,加0.5 mL抗原(1:20)。

        2.2.4 配制比濁管

        每次試驗(yàn)均配制比濁管作為判定凝集反應(yīng)程度的依據(jù)。先將抗原(1:20)用等量稀釋液作一倍稀釋,然后按表1配制比濁管。

        表1 比濁管的配制

        2.2.5 感作

        所有試驗(yàn)管充分震蕩后,置37℃溫箱感作20h。

        2.2.6 結(jié)果判定

        比照比濁管判讀,出現(xiàn)++以上凝集現(xiàn)象的最高血清稀釋度為血清凝集價(jià)。

        當(dāng)陰性血清和抗原對(duì)照不出現(xiàn)凝集,陽(yáng)性血清的凝集價(jià)達(dá)到其標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)±1個(gè)滴度,則證明試驗(yàn)成立,可以進(jìn)行待檢血清陰陽(yáng)性判定。否則,試驗(yàn)重做。

        2.2.7 試管凝集試驗(yàn)結(jié)果不確定度來(lái)源分析

        試管凝集試驗(yàn)結(jié)果的不確定度按照試驗(yàn)過(guò)程分析,主要來(lái)源于兩個(gè)過(guò)程:試管凝集試驗(yàn)過(guò)程和對(duì)反應(yīng)結(jié)果的儀器測(cè)定過(guò)程,分為A類不確定度和B類不確定度。

        來(lái)源于試管凝集試驗(yàn)過(guò)程的不確定度的分量即重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度。來(lái)源于濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的不確定度包括:濁度計(jì)測(cè)量的不重復(fù)性引入的不確定度、移液器引入的不確定度、測(cè)量瓶引入的不確定度、濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。不確定度來(lái)源匯總見(jiàn)表2。

        表2 不確定度來(lái)源匯總

        2.2.7.1 不確定度傳播公式[3]

        u2(y)=u2(R)+ +u2(M)

        u2(R)——重復(fù)檢測(cè)引入的方差

        u2(M)——濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程引入的方差

        擴(kuò)展不確定度:U(y)=k u(y)

        2.2.7.2 比濁管濁度值的測(cè)定

        對(duì)5個(gè)濃度的比濁管進(jìn)行濁度測(cè)試,試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

        表3 比濁管濁度值的測(cè)定

        2.2.7.3 試驗(yàn)用陽(yáng)性血清稀釋度的確定

        將陽(yáng)性血清進(jìn)行7個(gè)稀釋度的倍比稀釋,即:1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200,按照試驗(yàn)程序進(jìn)行試驗(yàn)后,對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定并測(cè)定濁度值。

        試驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

        表4 陽(yáng)性血清稀釋度的確定

        根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,選擇眼觀濁度與比濁管相對(duì)應(yīng),且平均濁度值與比濁管最為接近的不同的5個(gè)稀釋度的值進(jìn)行計(jì)算,即:1:50、1:400、1:800、1:1600、1:3200。

        2.2.7.4 重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度根據(jù)貝塞爾公式[3],由重復(fù)試驗(yàn)引入的方差:

        計(jì)算各稀釋度對(duì)應(yīng)的方差見(jiàn)表5。

        表5 各稀釋度對(duì)應(yīng)的方差

        2.2.7.5 濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的方差u2(M)的計(jì)算

        依據(jù)JJG 880-2006,濁度儀示值的相對(duì)誤差按式(1)計(jì)算:

        式中:M— —儀器示值相對(duì)誤差;

        Tm— —濁度測(cè)量的平均值,NTU;

        Ts— —稀釋后濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值,NTU;

        V2— —測(cè)量瓶定容體積,mL;

        V1— —移液器取樣體積,mL;

        T— —濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值,NTU。

        根據(jù) u2c(y) = Σ[?f/?xi]2u2(xi) ,可知:

        其中:c1=?Δ/?Tm=V2/V1T;

        c2= ?Δ/?V2=Tm/V1T

        c3= ?Δ/?V1=TmV2/TV21;

        c4= ?Δ/?T=TmV2/V1T2

        濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的不確定度主要來(lái)源于以下幾方面:儀器重復(fù)測(cè)量引入的不確定度;標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后濁度標(biāo)準(zhǔn)值引入的不確定度(包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的稀釋以及溫度對(duì)溶液稀釋的影響引入的不確定度)。

        選擇與稀釋度 1:50、1:400、1:800、1:1600、1:3200的平均濁度測(cè)量值相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋度進(jìn)行試驗(yàn),即 0NTU、5NTU、12NTU、18NTU、28NTU的標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋液進(jìn)行濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的不確定度評(píng)估,見(jiàn)表6。

        表6 濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的方差u2(M)各分量

        (1)濁度計(jì)測(cè)量的重復(fù)性引入的不確定度

        根據(jù)濁度計(jì)說(shuō)明書(shū),該儀器的測(cè)量重復(fù)性≤1%,按照1%計(jì)算,計(jì)算結(jié)果如表7。

        表7 測(cè)量重復(fù)性方差u2(Tm)

        18.205 0.1822 5 28.17 0.2817 4 2

        (2)移液器引入的不確定度

        本實(shí)驗(yàn)使用的是量程范圍為20-100μL和100-1000μL的移液器。由于20-100μL移液器帶來(lái)的不確定度很小,可以忽略不計(jì),只需計(jì)算100-1000μL的移液器帶來(lái)的不確定度。根據(jù)該移液器校準(zhǔn)證書(shū),該量程誤差為0.46%。根據(jù)公式:u(V1)=a/k,由移液器引入的方差的計(jì)算結(jié)果如表8。

        表8 移液器引入的方差u2(V1)

        (3)測(cè)量瓶引入的不確定度

        測(cè)量瓶引入的方差主要有2個(gè)來(lái)源:

        ①測(cè)量瓶體積校準(zhǔn):所用測(cè)量瓶體積為17.00±0.02 mL,為均勻分布;

        ②測(cè)量時(shí)測(cè)量瓶和溶液溫度與校準(zhǔn)時(shí)溫度不同引入的不確定度:測(cè)量瓶的校準(zhǔn)溫度為25℃,而實(shí)驗(yàn)室溫度在25℃ ±4℃范圍內(nèi)變化。由于溶液體積膨脹系數(shù)明顯大于測(cè)量瓶體積的膨脹系數(shù),因此可以只考慮前者的影響。水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃,溫度帶來(lái)的方差計(jì)算公式為:膨脹系數(shù)×溫度變化半寬度×測(cè)量瓶體積,為均勻分布。測(cè)量瓶引入的方差計(jì)算結(jié)果如表9。

        表9 測(cè)量瓶引入的方差u2(V2)

        (4)濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

        濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)給出相對(duì)擴(kuò)展不確定度為Uref=3% ,換算為擴(kuò)展不確定度為:

        U=400×3%=12(NTU)

        取包含因子k=2,故標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

        U(T)=12/2=6(NTU)

        U2(T)=36(NTU2)[5]

        (5)濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的合成不確定度

        表10 各濁度范圍對(duì)應(yīng)的合成不確定度

        2.2.7.5 總合成不確定度不確定度見(jiàn)表11。

        表11 各濁度范圍對(duì)應(yīng)的總合成不確定度

        2 1:400 +++ 0.571 3 1:800 ++ 1.125 4 1:1600 + 0.78 5 1:3200 - 1.4619

        2.2.7.6 擴(kuò)展不確定度

        取包含因子 k=2,根據(jù)公式 U(y)=ku(y)[5],則相應(yīng)的擴(kuò)展不確定度見(jiàn)表12。

        表12 各濁度范圍對(duì)應(yīng)的擴(kuò)展不確定度

        2.2.7.7 各方差組分對(duì)結(jié)果總方差的貢獻(xiàn)

        根據(jù)不確定度傳播公式:u2(y)=u2(R)+u2(M)

        總方差等于檢測(cè)過(guò)程引入的方差與濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程引入的方差之和,表13顯示了各稀釋度對(duì)應(yīng)的檢測(cè)過(guò)程引入的方差u2(R)和濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程引入的方差u2(M)對(duì)結(jié)果總方差的貢獻(xiàn)。

        表13 牛布氏桿菌病試管凝集實(shí)驗(yàn)各方差分量對(duì)結(jié)果總方差的貢獻(xiàn)

        3 結(jié)果分析和應(yīng)用

        牛布氏桿菌病試管凝集實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于兩個(gè)過(guò)程:試管凝集實(shí)驗(yàn)過(guò)程和對(duì)反應(yīng)結(jié)果的儀器測(cè)定過(guò)程,即重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度和濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的不確定度。來(lái)源于濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程的不確定度又包括濁度計(jì)測(cè)量的不重復(fù)性引入的不確定度、移液器引入的不確定度、測(cè)量瓶引入的不確定度、濁度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度。

        由表13可以看出,對(duì)于各標(biāo)準(zhǔn)血清稀釋度(測(cè)量值的濁度范圍),不確定度主要來(lái)自于重復(fù)檢測(cè)引入的不確定度,即來(lái)自于實(shí)驗(yàn)過(guò)程;濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程引入的不確定度相對(duì)較小;實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度大于濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生不確定度的3倍以上。因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,應(yīng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作,保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,降低檢測(cè)的不確定性。

        動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行試管凝集試驗(yàn)時(shí),大多要求對(duì)血清樣品在一個(gè)指定校價(jià)(濃度)的情況下進(jìn)行檢測(cè),如“被檢血清1:6陰性”。這時(shí),實(shí)驗(yàn)室將被檢血清做1:6稀釋后加入相應(yīng)稀釋好的抗原進(jìn)行反應(yīng)。如果凝集價(jià)達(dá)到“++”或“+++”、“++++”,即被認(rèn)為是陽(yáng)性反應(yīng)。本研究計(jì)算了不同血清稀釋度檢測(cè)結(jié)果的不確定度,可以看出,不同稀釋度樣品檢測(cè)結(jié)果的不確定度有差異,應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注的是涉及到陰陽(yáng)性判定檢測(cè)結(jié)果。對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō),需要重點(diǎn)關(guān)注的就是“++”和“+”的結(jié)果。

        (1)“++”的檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)于一個(gè)給定的樣品,可以采用與定量檢測(cè)結(jié)果相同的方式表述該類實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果真值的范圍,即檢測(cè)值(濁度值)±不確定度,即可得到測(cè)得值的分散范圍。

        在本實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于“++”的檢測(cè)結(jié)果,應(yīng)該考慮其數(shù)值的上限(“++”檢測(cè)值+不確定度)是否有大于“+”比濁管濁度值的下限(“+”比濁管檢測(cè)值-比濁管不確定度)的可能。

        如果:X(++)+U(y)(++)≥ X(+比濁管)- U(y)(+比濁管)

        說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為“++”樣品的檢測(cè)結(jié)果有超出陰性檢測(cè)結(jié)果下限的可能,檢測(cè)結(jié)果值的范圍有交叉,則應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待檢測(cè)結(jié)果。見(jiàn)圖1。

        圖1 “++”檢測(cè)結(jié)果的判定

        在以上3種情況下,檢測(cè)結(jié)果為“++”樣品的檢測(cè)結(jié)果上限均超出了“+”比濁管的濁度值下限,說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果可疑,該應(yīng)考慮重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

        (2)“+”的檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)于“+”的檢測(cè)結(jié)果,應(yīng)該考慮其數(shù)值的下限(“+”檢測(cè)值-不確定度)是否有小于“++”比濁管濁度值的上限(“++”比濁管檢測(cè)值+比濁管不確定度)的可能。

        如 果: X(+)- U(y)(+)≤ X(++比濁管)+U(y)(++比濁管)

        說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果為“+”樣品的檢測(cè)結(jié)果有超出陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果上限的可能,檢測(cè)結(jié)果值的范圍有交叉,則應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待檢測(cè)結(jié)果。見(jiàn)圖2。

        圖2 “+”檢測(cè)結(jié)果的判定

        在以上3種情況下,檢測(cè)結(jié)果為“+”樣品的檢測(cè)結(jié)果下限均超出了“++”比濁管濁度值的上限,說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果可疑,該應(yīng)考慮重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

        4 討論

        根據(jù)《測(cè)量不確定度表示指南》(GUM),測(cè)量不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的一個(gè)參數(shù),用以表征合理地賦予被測(cè)量之值的分散性。在測(cè)量科學(xué)領(lǐng)域,不確定度目前已經(jīng)應(yīng)用的較為廣泛,但在動(dòng)物檢疫領(lǐng)域,不確定度的應(yīng)用還是一個(gè)很新的概念,多數(shù)工作還停留在理論研究階段,許多技術(shù)人員對(duì)不確定度缺乏了解,更談不上應(yīng)用。

        由于生物檢測(cè)過(guò)程的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的種種不確定性,使得對(duì)于檢測(cè)結(jié)果不確定度的評(píng)估很困難。很多的動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果屬于定性結(jié)果或者半定量結(jié)果,無(wú)法對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行不確定性的評(píng)估,從而對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可信度不能進(jìn)行量化,使得實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)結(jié)果的比較變得十分困難。因此,國(guó)內(nèi)外動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法不確定度的評(píng)估仍處于初步探討的階段。

        本研究以牛布氏桿菌病為例,研究了試管凝集實(shí)驗(yàn)測(cè)量不確定度的評(píng)估方法。試驗(yàn)中引入了濁度的概念,將試管凝集實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行量化,轉(zhuǎn)化成為數(shù)值,從而使對(duì)該實(shí)驗(yàn)不確定度的評(píng)估成為可能。將總的不確定度按照實(shí)驗(yàn)過(guò)程分解成了實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度和濁度計(jì)測(cè)定過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度,建立了對(duì)該試驗(yàn)不確定度的評(píng)估方法。

        本研究對(duì)不同血清稀釋度的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了不確定度的評(píng)估。研究結(jié)果表明,不同抗體濃度下,檢測(cè)結(jié)果的不確定度不同。在本試驗(yàn)中,需要關(guān)注的是檢測(cè)結(jié)果為“++”和“+”樣品的不確定度。但在不同的實(shí)驗(yàn)中,對(duì)于不同的檢測(cè)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn),需要關(guān)注的目標(biāo)可能不同。本研究總結(jié)出了實(shí)際工作中應(yīng)用不確定度數(shù)值的方法,為如何確定試管凝集實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果真值的范圍提供有益的參考,為動(dòng)物檢疫領(lǐng)域半定量和定性類檢測(cè)結(jié)果的不確定度評(píng)估提供了思路。

        [1] NATIONAL STANDARD METHOD:AGGLUTINATION TEST(BSOPTP 3).Issued by Standards Unit,Department for Evaluations,Standards and Training,Health Protection Agency of Ireland.

        [2] SN/T1088-2010布氏桿菌檢疫技術(shù)規(guī)范[S].

        [3] JJF 1059-1999測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定[S].

        [4] JJG 880 -2006濁度計(jì)檢定規(guī)程[S].

        [5] 中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)秘書(shū)處.實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可與管理基礎(chǔ)知識(shí)(試行版).2007.

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